Farmacoproteómica del
condroitín sulfato
I
m/z
Valentina Calamia & Cristina Ruiz-Romero
Unidad de Proteómica-ProteoRed/ISC...
 Búsqueda de marcadores diagnósticos o pronósticos de la
enfermedad en fluidos biológicos
 Comprensión de los mecanismos...
 Búsqueda de marcadores diagnósticos o pronósticos de la
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TRATAMIENTOS: ESCALERA TERAPÉUTICA
• Terapia física
• Calzado
apropiado /
ayudas para
andar
• Hidroterapia
• Rehabilitació...
Efecto rápido y potente
No modifican la evolución
de la enfermedad
Escasa seguridad
Posibles interacciones
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 48 spots alterados
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EFECTO DEL CS EN EL PROTEOMA DEL CONDROCITO N
Efecto del CS en el proteoma de condrocitos N tratados con IL1b
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ligero
 Tratamiento con CS e IL
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CONCLUSIONES
Conclusiones
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Estudio proteómico MOVES
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Proteomics Group
ProteoRed-PRB2/ISCIII
Cristina Ruiz-Romero
Dr. Francisco J.
Blanco
Rheumatology Division
INIBIC-Hospital ...
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Farmacoproteómica del condroitín sulfato- Unidad de proteómica- ProteoRed

Ponencia Valentina Calamia y Cristina Ruiz-Romero
Published on: Mar 4, 2016
Published in: Health & Medicine      
Source: www.slideshare.net


Transcripts - Farmacoproteómica del condroitín sulfato- Unidad de proteómica- ProteoRed

  • 1. Farmacoproteómica del condroitín sulfato I m/z Valentina Calamia & Cristina Ruiz-Romero Unidad de Proteómica-ProteoRed/ISCIII Grupo de Investigación en Reumatología INIBIC-Hospital Universitario A Coruña Jornada Cátedra Bioibérica A Coruña, 18 Noviembre 2015
  • 2.  Búsqueda de marcadores diagnósticos o pronósticos de la enfermedad en fluidos biológicos  Comprensión de los mecanismos patofisiológicos SUERO/PLASMA LIQUIDO SINOVIAL CARTÍLAGO CONDROCITOS PROTEÓMICA Y ARTROSIS (OA) Introducción  Evaluación de fármacos o de sustancias con potencial farmacológico (Drug profiling)  Monitorización de ensayos clínicos  Personalización y optimización del tratamiento FARMACOPROTEÓMICA CONDROITÍN SULFATO
  • 3.  Búsqueda de marcadores diagnósticos o pronósticos de la enfermedad en fluidos biológicos  Comprensión de los mecanismos patofisiológicos SUERO/PLASMA LIQUIDO SINOVIAL CARTÍLAGO CONDROCITOS Introducción  Evaluación de fármacos o de sustancias con potencial farmacológico (Drug profiling)  Monitorización de ensayos clínicos  Personalización y optimización del tratamiento FARMACO- PROTEÓMICA CONDROITÍN SULFATO (CS) PROTEÓMICA Y ARTROSIS
  • 4. TRATAMIENTOS: ESCALERA TERAPÉUTICA • Terapia física • Calzado apropiado / ayudas para andar • Hidroterapia • Rehabilitación • Lavado articular • Transplante de condrocitos • Artroscopia • Artroplastia • Medicina regenerativa • Dieta • Terapia farmacológica sistémica, tópica y/o • Intra-articular • Ejercicio moderado colaboración y educación paciente protección articular ejercicio tratamiento farmacológico tratamiento quirúrgico Introducción
  • 5. Efecto rápido y potente No modifican la evolución de la enfermedad Escasa seguridad Posibles interacciones SINTOMÁTICOS DE ACCIÓN RÁPIDA: • PARACETAMOL • AINEs • GLUCOCORTICOIDES • COXIB SINTOMÁTICOS DE ACCIÓN LENTA (SYSADOA): • CONDROITÍN SULFATO • SULFATO DE GLUCOSAMINA • ÁC. HIALURÓNICO • DIACEREÍNA Efecto lento y prolongado Modifican el curso de la enfermedad Elevada seguridad Baja relación coste/efectividad TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO DE OA Introducción DMOAD (DISEASE MODIFYING OSTEOARTHRITIS DRUG)
  • 6. 1. Análisis del efecto del CS y GS sobre el proteoma de condrocitos articulares humanos normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β). ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS 2. Análisis del efecto del CS sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos y normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β). 3. Análisis del efecto del 3 CS sobre el proteoma y secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos. 4. Análisis del efecto de CS y GH sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos mediante iTRAQ.
  • 7. 1. Análisis del efecto del CS sobre el proteoma de condrocitos articulares humanos normales estimulados con interleuquina 1- beta (IL1β). Efecto del CS en el proteoma de condrocitos N tratados con IL1b ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS
  • 8. Efecto del CS en el proteoma de condrocitos N tratados con IL1b A B 2-DE  650 spots detectados  48 spots alterados  35 spots identificados EFECTO DEL CS EN EL PROTEOMA DEL CONDROCITO N
  • 9. EFECTO DEL CS EN EL PROTEOMA DEL CONDROCITO N Efecto del CS en el proteoma de condrocitos N tratados con IL1b GS CS PDIA1 PDIA3# HSP7C GELS ANXA1 ANXA2# TPIS AK1C2 KPYM1 GS+CS ANXA5 GDIR GRP78 ACTB SODM ENOA* PRDX1 HSPB1* CO6A1 HSPB1* DPYL2 PGAM1 TAGL2 GANAB SEPT2 GSTP1 ENOA* EF1G TCPG UGDH PGK1 ATPA G3P ALDOA CO6A1  Grp78: UPR, propiedades antiinflamatorias  SOD2: enzima relacionada con estrés oxidativo
  • 10. CS Y FUNCIÓN MITOCONDRIAL CS y mitocondria CTL IL1β IL1 β +CS SOD2 TUB Calamia V et al., ART 2010 * * & Incrementa producción ATP * & Disminuye ROS Disminuye actividad SOD Mitocondria, posible diana de la condroprotección mediada por CS
  • 11. ESTRUCTURA DEL CARTÍLAGO ARTICULAR COMPONENTE CELULAR Condrocitos (1,5% del volumen total) MATRIZ EXTRACELULAR (98% del volumen total) Peso total • Agua (70-80%) • Proteínas (20-30%) Peso seco • Colágeno tipo II (50%) • Proteoglicanos (30-35%) • Otras proteínas de matriz (15-20%) Adaptada J. Martel-Pelletier et al. OA&C (2010) keratan sulfato condroitín sulfato MATRIZ EXTRACELULAR
  • 12. 2. Análisis del efecto del CS sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos y normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β). Efecto del CS en el secretoma de condrocitos N tratados con IL1b y condrocitos OA ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS
  • 13. A B  Cultivo de condrocitos en medios pesado y ligero  Tratamiento con CS e IL  Extracción de proteínas  Separación por LC  Análisis por MS EFECTO DEL CS EN EL SECRETOMA DEL CONDROCITO HPLC Efecto del CS en el secretoma de condrocitos N tratados con IL1b y condrocitos OA Arg 0/Lis 0 “light” Arg 10/Lis 6 “heavy” ΔDa SILAC
  • 14. EFECTO DEL CS EN SECRETOMA DE CONDROCITOS Efecto del CS en el secretoma de condrocitos N tratados con IL1b y condrocitos OA Ratio CS/BASAL pValue Collagen alpha-1(I) chain 2,63 0,0027 Collagen alpha-1(VI) chain 1,97 0,0062 Collagen alpha-2(I) chain 2,61 0,0001 Lumican 1,38 0,0003 Decorin 2,70 0,0071 Chitinase-3-like protein 1 (YKL-40) 1,52 0,0699 Insulin-like growth factor-binding protein 3 2,99 0,0099 Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1) 2,04 0,0668 Fibronectin 1,81 0,0001 Vimentin 2,01 0,0005 20% 10% 10% 60% componentes MEC factores de crecimiento remodelación MEC estructurales ANABÓLICO Ratio IL/BASA L Ratio IL+CS/IL Interstitial collagenase (MMP1) +++ 0,69 72 kDa type IV collagenase (MMP2) 3,45 0,74 Stromelysin-1 (MMP3) +++ 0,8 Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1) 1,4 0,8 Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC) 0,4 1,5 Glia derived nexin (SERPINE2) 17,6 1,41 Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein (TNFAIP6) +++ 2,99 Decorin 0,66 1,27 Tenascin 1,9 0,7 Fibromodulin - 1,27 Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) 1,61 0,74 Interleukin-6 +++ 0,61 Interleukin-8 +++ 0,57 Transforming growth factor-beta- induced protein ig-h3 (TGFBI) 2,87 0,73 ANTI- CATABÓLICO ANTI- INFLAMATORIO Condrocitos OA Condrocitos N+IL1b
  • 15. 3. Análisis del efecto de 3 CS sobre el proteoma y secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos. ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS Efecto de 3 CS en el proteoma y secretoma de condrocitos OA
  • 16. Efecto de 3 CS en el proteoma y secretoma de condrocitos OA EFECTO DIFERENCIAL DE 3 CS EN EL CONDROCITO OA CS1 CS2 CS3 SPECIES PURITY 90.4 % 96.2 % 99.9 % Proteoma (2D-DIGE) Secretoma (SILAC)
  • 17. Modulated proteins CS1 CS2 CS3 Actin, cytoplasmic 2 0,82 0,54 1,22 Annexin A2 0,66 Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) 1,29 Cathepsin D 0,72 Chitinase-3-like protein 2 3,01 Collagen alpha-1(I) chain 1,37 Collagen alpha-1(III) chain 1,60 Collagen alpha-1(XII) chain 0,79 0,84 Collagen alpha-1(XV) chain 0,51 0,62 1,30 Collagen alpha-3(VI) chain 0,44 Connective tissue growth factor 1,59 Fibronectin 1,27 Fibulin-1 1,54 Follistatin-related protein 1 1,20 Glia-derived nexin 1,54 Hyaluronan and proteoglycan link protein 1 0,65 Insulin-like growth factor-binding protein 2 1,28 1,27 Insulin-like growth factor-binding protein 3 1,19 Insulin-like growth factor-binding protein 7 1,64 1,43 1,53 Interstitial collagenase (MMP1) 28,71 Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1) 1,37 Nucleobindin-1 1,20 Pentraxin-related protein 2,41 Periostin 0,58 Plasminogen activator inhibitor 1 1,33 Prolargin (PRELP) 1,93 Serpin H1 0,61 Stromelysin-1 (MMP3) 13,44 Tenascin 1,22 0,74 Thrombospondin-1 1,83 1,24 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 0,78 0,60 Vimentin 1,46 Efecto de 3 CS en el proteoma y secretoma de condrocitos OA • El CS porcino induce rutas inflamatorias y catabólicas • El CS bovino (99%) induce anabolismo • Utilidad del análisis proteómico para el screening de fármacos anti-OA
  • 18. 4. Análisis del efecto de CS y GH sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos mediante iTRAQ. ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS Efecto de CS en el secretoma de condrocitos OA
  • 19. EFECTO DE CS Y GH SOBRE EL SECRETOMA Efecto de CS en el secretoma de condrocitos OA GO_id Term Nº of protein p-value GO:0030198 extracellular matrix organization 41 2.71E-38 GO:0030199 collagen fibril organization 15 5.89E-19 GO:0001501 skeletal system development 33 6.4E-17 GO:0007155 cell adhesion 41 1.41E-13 GO:0046903 secretion 33 1.43E-13 GO:0061448 connective tissue development 17 1.65E-10 GO:0001503 ossification 18 4.2E-10 GO:0051216 cartilage development 15 5.71E-10 GO:0016192 vesicle-mediated transport 35 8.41E-9 GO:0001525 angiogenesis 19 9.22E-9 GO:0032963 collagen metabolic process 8 2.98E-8 GO:0001502 cartilage condensation 6 2.12E-7 GO:0030334 regulation of cell migration 21 2.52E-7 GO:2000145 regulation of cell motility 21 6.18E-7 GO:0006950 response to stress 68 6.76E-7 GO:0036293 response to decreased oxygen levels 16 7.52E-7 GO:0042127 regulation of cell proliferation 39 8.03E-7 GO:0006916 anti-apoptosis 16 8.5E-7 260 PROTEÍNAS DISMINUIDAS POR EFECTO DEL CS Degradación MEC Cathepsin D 75% Cathepsin L1 69% Chaperonas Calreticulin 49% Heat shock protein HSP 90-beta 57% INCREMENTADAS POR EFECTO DEL CS Componentes MEC Aggrecan core protein 56% Hyaluronan and proteoglycan link prot 1 73% Adhesión celular Tenascin 71% Thrombospondin-1 90% Vascular cell adhesion protein 1 43% Coiled-coil domain-containing protein 80 77% Thrombospondin-1 (TSP1): Inhibidor de angiogénesis
  • 20. INCREMENTO DE TSP1 POR CS Efecto de CS en el secretoma de condrocitos OA 1,00 0,07 0,22* 0,01 0,1 1 10 BASAL IL1β IL1β+CS 1,00 2,09 0 0,5 1 1,5 2 2,5 BASAL CS OA N CTL CS CTL IL1β IL1β+CS 1,00 0,45 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 N OA N OA mRNA TSP1 WB CTL GH CS C+G TSP1 TUB CTL IL1β IL+CS TSP1 (secretoma) TSP1 (proteoma) TUB WB Los niveles de TSP1 están disminuidos en condrocitos OA vs N y en condrocitos N estimulados con IL1β. mRNATSP1/mRNAhousekeepinggene CS aumenta los niveles de TSP1 (mRNA y proteína) en ambos casos. La inhibición de angiogénesis, posible mecanismo de acción del CS
  • 21. CONCLUSIONES Conclusiones Los estudios de farmacoproteómica del CS han permitido: • Profundizar en el conocimiento de los mecanismos de acción del CS en las células del cartílago articular. • Poner de manifiesto el papel del CS sobre la función mitocondrial y la inhibición de la angiogénesis, entre otros. • Evaluar el efecto de diferentes composiciones de CS en las células del cartílago articular.
  • 22. MÁS FÁRMACOPROTEÓMICA… Estudio proteómico MOVES Identificación de proteínas marcadoras de respuesta terapéutica a CS+GS (Droglican) o Celecoxib (Celebrex) Estudio proteómico en suero de pacientes del Multicentre Osteoarthritis interVEntion trial with Sysadoa (MOVES) Identificación mediante iTRAQ y LC-MS/MS de proteínas cuantitativamente alteradas en respondedores a los fármacos …Continuará!
  • 23. Proteomics Group ProteoRed-PRB2/ISCIII Cristina Ruiz-Romero Dr. Francisco J. Blanco Rheumatology Division INIBIC-Hospital Universitario de A Coruña Valentina Calamia Jesús Mateos Patricia Fernández-Puente Beatriz Rocha Lucía Lourido María Camacho Nancy M. Parra Lucía González MJ López-Armada (CS y mitocondria) Colaboradores

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