Alma Mater Studiorum- Università degli Studi di Bologna DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE MORFOLOGICHE ...
INDICE
1.INTRODUZIONE 11.1 NANOSCIENZA E NANOTECNOLOGIA ...
3. MATERIALI E METODI 423.1 CELLULE CD34+ DA MIDOLLO OSSEO UMANO ...
4.6 INTERAZIONE DELLE NANOPARTICELLE CON PROTEINE SIERICHE 704.7 CARATTERIZZAZIONE DELLE NANOPARTICELLE ...
1. INTRODUZIONE 2
1.1 NANOSCIENZA E NANOTECNOLOGIAIl concetto di nanoscienza fu formulato per la prima volta dal fisico Richard Feynman n...
Le nanotecnologie trovano applicazione in praticamente tutti i settori produttivi.Numerosi prodotti riconducibili all’util...
1.2 NANOMATERIALII nanomateriali, per definizione, sono materiali con almeno una dimensione nel range tra1 e 100 nm. Essi ...
1.2.1 Nanomateriali prodotti dalle nanotecnologieI nanomateriali più prodotti al giorno d’oggi a livelo globale sono quell...
Buckyball (Fullerene C60) Nanotubi single-wall a)armchair; b)zig-zag; c)chiralNanotubi multiple-wall ...
ii) I nanomateriali composti da metalli includono quantum dots, nanogold, nanosilver e ossidi di metalli come il dios...
iii) I dendrimeri sono polimeri di dimensioni nano, costituiti da unità ramificate. La superficie di un dendrimero h...
1.2.2 Nanomateriali presenti nell’inquinamento ambientaleI tipi di nanomateriali principalmente presenti nell’inquinamento...
massa rappresentano la minoranza delle particelle, in termini di numero sono certamentele più abbondanti tra il materiale ...
1.3 PROPRIETA’ DEI NANOMATERIALILe proprietà particolari dei nanomateriali sono dovute al fatto che, per le loro dimension...
D’altro canto, sembra che anche gli effetti indesiderati dei nanomateriali siano dovuti aqueste stesse caratteristiche che...
1.3.1 Metodi di valutazione delle proprietà superficialiSiccome le applicazioni tecniche dei nanomateriali dipendono grand...
possono essere controllate con una risoluzione inferiore all’atomo. Sono metodi moltopotenti per misurare la struttura e t...
1.4 APPLICAZIONI DEI NANOMATERIALII nanomateriali, indipendentemente dalla loro natura (metalli, ceramiche, polimeri,mater...
1.4.1 Applicazioni biomedicheNegli ultimi anni, molti sforzi sia economici che intellettuali si sono rivolti alle possibil...
modificazione superficiale. Particolarmente promettente sembra essere il settore deitessuti e degli impianti artificiali d...
Nanoparticelle metalliche possono formare il core del nanomateriale, che vienefunzionalizzato in superficie mediante il le...
Nanovescicole o nanotubi, invece, sono composti da carbonio e metalli, e formano cavitàche possono essere riempiti con far...
Nonostante le nanotecnologie promettano benefici enormi per la società e grossi capitalisiano sempre più investiti in ques...
composti inorganici poco solubili), mentre i nanomateriali ingegnerizzati sono soluzionimonodisperse di solidi a composizi...
1.5.1 Biocinetica delle nanoparticelleL’esposizione ai nanomateriali può avvenire attraverso atmosfera, cibo, acqua, prodo...
Kreying et al. hanno dimostrato che l’uptake da parte del sistema mononuclearefagocitario dipende dalle dimensioni delle n...
1.5.2 Interazione dei nanomateriali con il sistema reticolo-endotelialeIl sistema reticolo-endoteliale è costituito da cel...
I metalli associati al nanoparticolato atmosferico sono responsabili di stress ossidativo alivello cellulare (11, 53), ed ...
contrario. L’interèpretazione di studi in vitro è a volte resa difficile dal fatto che venganoutilizzate particelle di com...
depositate nel polmone, eludeno il controllo dei macrofagi alveolari e riescano adinfiltrarsi nello spazio interstiziale, ...
1.5.5 Tossicità cardio-vascolare delle nanoparticelleLa maggior parte dei dati sulla tossicità delle nanoparticelle deriva...
un rilascio di radicali liberi, citochine e chemochine nella circolazione sanguigna (15), cheagiscono negativamente sulla ...
un’associazione tra nanoparticelle presenti nel cervello e l’aumento dei markerdell’infiammazione e accumulazione di AB42 ...
1.6 EMATOPOIESIL’emopoiesi, ovvero la formazione di tutte le cellule del sangue, avviene nel midollo osseopartendo dalle c...
Quando la cellula staminale ematopoietica riceve un segnale di differenziamento, essapuò diventare un progenitore linfoide...
I precursori che formano colonie in 14 giorni rappresentano uno stadio intermerdio tracellule staminali pluripotenti in gr...
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1.7 SCELTA DELLE NANOPARTICELLE E DEL MODELLO CELLULARE1.7.1 La scelta delle nanoparticelleLe nanoparticelle che abbiamo d...
commercializzati. Un’altra importante caratteristica è la possibilità di assemblare sulla lorosuperficie un monostrato ord...
Nanoparticella di Fe3O4 (in rosso) con attaccate delle molecole di acido oleico che leganomolecole di arsenico (in verde-b...
-nanoparticelle di Co: Le nanoparticelle di cobalto, come quelle di magnetite e di ematite,sono interessanti in nanotecnol...
Le colture di cellule primarie, seppur mantenendo i limiti dati dall’artificiosità della colturain vitro, è probabilmente ...
2. SCOPO DELLA TESI 40
Scopo della tesiNonostante le nanotecnologie promettano benefici enormi per la società e grossi capitalisiano sempre più i...
3. MATERIALI E METODI
Materiali e Metodi3.1 CELLULE CD34+ DA MIDOLLO OSSEO UMANOLe cellule progenitrici CD34+ di midollo osseo da 9 donatori san...
Materiali e Metodial 30%. I campioni sono stati misurati 10 volte, e le misurazioni sono state fatte a 25oC conun angolo d...
Materiali e Metodi3.5 COLTURA LIQUIDA DELLE CELLULE PROGENITRICI CD34+ MIDOLLARIL’espansione dei progenitori CD34+ proveni...
Materiali e Metodi3.7 PCR QUANTITATIVAL’RNA totale ès tato estratto dai campioni cellular mediante l’utilizzo di un kit co...
Materiali e Metodistata supplementata con 100ng/ml vinblastina ogni settimana, per mantenere la selezione(29). Il terreno ...
Materiali e Metodicentrifugando a 3,000xg per 5 minuti a 20oC in PBS, RIPA buffer oppure unImmunoPrecipitation Wash Buffer...
4. RISULTATI 49
Risultati4.1 EFFETTO DI 7 NANOPARTICELLE METALLICHE SULL’ABILITA’ DI CELLULEPROGENITRICI EMATOPOIETICHE DI FORMARE COLONIE...
RisultatiE’ da notare, comunque, che le colonie eritroidi cresciute in presenza di NP di Sb2O3 allaconcentrazione di 2.5 p...
Risultati d Number of colonies (% over control) ...
Risultati4.2 EFFETTO DELLE NANOPARTICELLE DI Sb2O3 SULL’ERITROPOIESIIn seguito alle osservazioni precedentemente illustrat...
Risultatifino a raggiungere una dimensione di circa 7 micrometri quando hanno espulso il nucleo.Come si vede in Figura 4.3...
RisultatiFigura 4.3 Analisi fenotipica delle cellule in fase proliferativa e fase differenziativa. (A)l’espressione di CD7...
RisultatiSeguendo questo metodo, il numero di cellule aumentava gradualmente in coltura, fino araggiungere una espansione ...
RisultatiCi siamo chiesti se l’effetto tossico fosse esercitato anche durante la fase deldifferenziamento. Per rispondere ...
Risultati4.3 ANALISI DELL’INTERAZIONE TRA Sb2O3 E CELLULE PROGENITRICI ERITROIDIUn elemento fondamentale per comprendere i...
RisultatiFigura 4.6 Analisi al microscopio elettronico (STEM). Cellule CD34+ del midollo osseoumano sono state cresciute p...
RisultatiL’inclusione intracellulare di NP di Sb2O3 in progenitori eritroidi non è stata osservata neicampioni analizzati....
Risultati4.4 ANALISI DEL SIGNALINGDai dati mostrati fin qui, si evince che le NP di Sb2O3 interagiscono con la membranacel...
Nano particelle tesi
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Published on: Mar 3, 2016
Source: www.slideshare.net


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  • 1. Alma Mater Studiorum- Università degli Studi di Bologna DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE MORFOLOGICHE UMANE E MOLECOLARI SETTORE DISCIPLINARE BIO/16 CITOTOSSICITA’ DI SETTE NANOPARTICELLE IN PROGENITORI EMATOPOIETICI ISOLATI DAL MIDOLLO OSSO UMANO Presentata da: Dott.ssa Lisa BregoliCoordinatore: Relatore:Chiar.mo Prof. Chiar.ma Prof.ssaLucio Cocco Lucia Manzoli Ciclo XXII Esame finale anno 2010
  • 2. INDICE
  • 3. 1.INTRODUZIONE 11.1 NANOSCIENZA E NANOTECNOLOGIA 21.2 NANOMATERIALI 4 1.2.1 Nanomateriali prodotti dalle nanotecnologie 5 1.2.2 Nanomateriali presenti nell’inquinamento ambientale 91.3 PROPRIETA’ DEI NANOMATERIALI 11 1.3.1 Metodi di valutazione delle proprietà superficiali 131.4 APPLICAZIONI DEI NANOMATERIALI 15 1.4.1 Applicazioni biomediche 161.5 NANOTOSSICOLOGIA 20 1.5.1 Biocinetica delle nanoparticelle 22 1.5.2 Interazione dei nanomateriali con il sistema reticolo- 24 endoteliale 1.5.3 Nanoparticelle e induzione della reazione infiammatoria 24 1.5.4 Tossicità polmonare dei nanomateriali 26 1.5.5 Tossicità cardio-vascolare delle nanoparticelle 28 1.5.6 Tossicità delle nanoparticelle nel sistema nervoso centrale 291.6 EMATOPOIESI 31 1.6.1 Saggio di proliferazione e differenziamento dei progenitori 32 ematopoietici (CFU assay)1.7 SCELTA DELLE NANOPARTICELLE E DEL MODELLO CELLULARE 35 1.7.1 La scelta delle nanoparticelle 35 1.7.2 La scelta del modello cellulare 382. SCOPO DELLA TESI 40 ii
  • 4. 3. MATERIALI E METODI 423.1 CELLULE CD34+ DA MIDOLLO OSSEO UMANO 433.2 NANOPARTICELLE 433.3 DINAMIC LIGHT SCATTERING (DLS) 433.4 CFU ASSAY 443.5 COLTURA LIQUIDA DELLE CELLULE PROGENITRICI CD34+ MIDOLLARI 453.6 CITOMETRIA A FLUSSO 453.7 PCR QUANTITATIVA 463.8 MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE-TRASMISSIONE (STEM) 463.9 COLTURA DELLE LINEE CELLULARI UMANE 463.10 GENE EXPRESSION ARRAY 473.11 PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE SIERICHE LEGATE ALLE 47NANOPARTICELLE3.12 ANALISI STATISTICA 484. RISULTATI 494.1 EFFETTO DI 7 NANOPARTICELLE METALLICHE SULL’ABILITA’ DI 50CELLULE PROGENITRICI EMATOPOIETICHE DI FORMARE COLONIE (CFUassay)4.2 EFFETTO DELLE NANOPARTICELLE DI Sb2O3 SULL’ERITROPOIESI 534.3 ANALISI DELL’INTERAZIONE TRA Sb2O3 E CELLULE PROGENITRICI 58ERITROIDI4.4 ANALISI DEL SIGNALING 614.5 EFFETTO DELLE NANOPARTICELLE DI Sb2O3 SU PROLIFERAZIONE E 67DIFFERENZIAMENTO DI LINEE CELLULARI iii
  • 5. 4.6 INTERAZIONE DELLE NANOPARTICELLE CON PROTEINE SIERICHE 704.7 CARATTERIZZAZIONE DELLE NANOPARTICELLE 725. DISCUSSIONE 75BIBLIOGRAFIA 79 iv
  • 6. 1. INTRODUZIONE 2
  • 7. 1.1 NANOSCIENZA E NANOTECNOLOGIAIl concetto di nanoscienza fu formulato per la prima volta dal fisico Richard Feynman nel1959 (Feynman, R. 1960. Engineering and Science, Vol. 23, No. 5, February, pp. 22-36.) neldiscorso intitolato “There’s plenty of room at the bottom-An invitation to enter a new fieldof physics”, durante il quale ipotizzò che nel futuro si sarebbero potuti costruire dispositividi varia natura agendo direttamente sulla posizione degli atomi nella materia.Il termine “nanotecnologia”, però, venne coniato soltanto quasi 30 anni più tardi da KimEric Drexler, nel suo libro intitolato “Engines of creation: the coming era ofnanotechnology” del 1986. Sorprendentemente, tutt’ora non esiste una definizioneuniversalmente accettata per nanoscienze e nanotecnologie, ma ve ne sono diverse similitra loro. Secondo la Royal Society & The Royal Academy of Engineering (UK), “Nanoscienceis the study of phenomena and manipulation of materials at atomic, molecular andmacromolecular scales, where properties differ significantly from those at a larger scale” e,secondo la National Nanotechnology Initiative (NNI) USA, “Nanotechnology is theunderstanding and control of matter at dimensions of roughly 1 to 100 nanometers, whereunique phenomena enable novel applications... At this level, the physical, chemical, andbiological properties of materials differ in fundamental and valuable ways from theproperties of individual atoms and molecules or bulk matter”.Le nanoscienze costituiscono il punto di incontro di discipline diverse che vanno dallafisica quantistica alla chimica supramolecolare, dalla scienza dei materiali alla biologiamolecolare e rappresentano una realtà ormai affermata nel mondo della ricerca. Lenanotecnologie, che sono invece ancora nella fase iniziale del loro sviluppo, puntano asfruttare e ad applicare i metodi e le conoscenze derivanti dalle nanoscienze. Esse fannoriferimento ad un insieme di tecnologie, tecniche e processi che richiedono un approcciomultidisciplinare e consentono la creazione e utilizzazione di materiali, dispositivi e sistemicon dimensioni a livello nanometrico. Le prospettive associate alla nanotecnologiederivano dal fatto che, a questi livelli di dimensioni, comportamenti e caratteristiche dellamateria cambiano drasticamente. 2
  • 8. Le nanotecnologie trovano applicazione in praticamente tutti i settori produttivi.Numerosi prodotti riconducibili all’utilizzo delle nanotecnologie sono già disponibili sulmercato (Woodrow Wilson Nanotech Inventory) o in procinto di esserlo, ed il loronumero cresce costantemente. Tra essi si possono citare, ad esempio, nanoparticelle percosmetici, coatings e vernici, tessuti che non si stropicciano e non rilasciano odori, articolisportivi; ma anche nanocompositi, “hard disks” con superfici nanostrutturate perregistrazione dati ad altissima densità, “chips” di memoria con dimensioni inferiori a 100nm, dispositivi fotonici, superfici autopulenti, sistemi per diagnostica medica basati, peresempio, sul principio “lab-on-chip”.Infine, alcune proprietà delle nanoparticelle, come una aumentata attività chimica, unamigliore selettività e l’abilità di attraversare le barriere tissutali, stanno portanto allosviluppo di nuove tecniche in ambito farmacologico. In futuro, una nanoparticella o ungruppo di nanoparticelle potranno essere progettata per cercare, individuare edistruggere una singola cellula patologica. Attraverso le nanotecnologie si potrannostimolare meccanismi di riparazione di tessuti malati o danneggiati, senza ricorrere atrapianti o organi artificiali. Entro i prossimi anni sono attesi, tra altri, sistemi avanzati perla somministrazione mirata di farmaci e protesi mediche più resistenti e con miglioratabiocompatibilità. 3
  • 9. 1.2 NANOMATERIALII nanomateriali, per definizione, sono materiali con almeno una dimensione nel range tra1 e 100 nm. Essi sono prodotti principalmente da due fonti ben distinte: da un latotroviamo i nanomateriali prodotti dalla nanotecnologia che, come detto, applica i principie metodi definiti dalla nanoscienza. Dall’altro lato, troviamo i nanomateriali presentinell’ambiente sotto forma di inquinamento, prodotti da ogni forma di combustione comevulcani, incendi, esplosioni, motori a combustione, caldaie per il riscaldamento, centralielettriche, inceneritori (Tabella 1).Tabella 1: Principali fonti di nanomaterialiNaturali Antropogeniche Non intenzionali IntenzionaliIncendi Motori a combustione Nanoparticelle interna ingegnerizzate:Vulcani Centrali elettriche Nanomaterali di carbonio Inceneritori Nanomateriali metallci Jet di aeroplani Dendrimeri Fumi metallici Compositi (siderurgia) Fumi polimerici Altri fumi Superfici riscaldate Cottura Motori elettrici 4
  • 10. 1.2.1 Nanomateriali prodotti dalle nanotecnologieI nanomateriali più prodotti al giorno d’oggi a livelo globale sono quelli di titanio, silicio,alluminio, metalli e carbonio. Esistono diverse classificazione per i nanomateriali prodottidalle nanotecnologie, che vengono progettati con l’intenzione di migliorare materiali edispositivi di uso corrente, ed avere un utilizzo in diversi settori come l’elettronica,l’industria tessile, l’edilizia, la sensoristica, l’industria chimica, l’industria automobilistica,la medicina e molti altri. Una classificazione di uso comune divide i nanomateriali in 4gruppi: i) nanomateriali di carbonio, ii) nanomateriali di metalli, iii) dendrimeri e iv)compositi. i) I nanomateriali di carbonio sono composti principalmente da carbonio, di solito nella forma di sfere vuote, ellissoidi o tubi. I nanomateriali di carbonio sferici o ellissoidi sono chiamati “fullereni”, mentre quelli cilindrici sono detti “nanotubi”. Queste particelle hanno diverse applicazioni potenziali, comprese lamine e ricoperture migliorate, materiali più forti e leggeri, ed applicazioni nel campo dell’elettronica. Inoltre, la possibilità di riempire i nanotubi e i fullereni di farmaci, e di fuonzionalizzare esternamente con peptidi questi nanomateriali, offre la possibilità di progettare sistemi innovativi di trasporto seletivo e controllao di farmaci e marcatori. 5
  • 11. Buckyball (Fullerene C60) Nanotubi single-wall a)armchair; b)zig-zag; c)chiralNanotubi multiple-wall 6
  • 12. ii) I nanomateriali composti da metalli includono quantum dots, nanogold, nanosilver e ossidi di metalli come il diossido di titanio (TiO2). Un quantum dot è un cristallo semiconduttore altamente impaccato di centinaia o migliaia di atomi, e le cui dimensioni sono nell’ordine da alcuni nanometri a alcune centinaia di nanometri. Al variare delle dimensioni dei quantum dots, variano le loro proprietà ottiche, e sono utilizzati per la loro capacità di emettere flurescenze diverse. Quantum dots di diverse dimensioni Nanoparticelle di TiO2 (anatase) 7
  • 13. iii) I dendrimeri sono polimeri di dimensioni nano, costituiti da unità ramificate. La superficie di un dendrimero ha numerose catene terminali, che possono essere ingegnerizzate per ottenere diverse funzionalità chimiche, per esemio catalisi. Inoltre, poiché dendrimeri tridimensionali contengono cavità interne in cui possono essere incluse altre molecole, posso essere utilizzati per il trasporto selettivo e controllato di farmaci, marcatori e oligonucleotidi. Utilizzando questo sistema di drug delivery, la nanomedicina molecolare rappresenta un grande sfida e promessa per la medicina del futuro. Dendrimeroiv) Infine, i compositi sono ottenuti combinando fra loro solidi di diversa natura e spesso costituiti da una matrice (metallica, polimerica o ceramica) che viene rinforzata con particelle di dimensioni nanometriche. Questa unione permette di ottenere sistemi ibridi con proprietà meccaniche, termiche e elettriche intermedie a quelle dei singoli costituenti e quindi materiali più resistenti, leggeri, poco sensibili alla corrosione, all’usura abrasiva. Vengono utlizzati per esempio per costruire componenti elettroniche, di automobili e materiali per imballaggio. Apparecchio spintronico costruito con nanomaterali compositi 8
  • 14. 1.2.2 Nanomateriali presenti nell’inquinamento ambientaleI tipi di nanomateriali principalmente presenti nell’inquinamento ambientale sonosoprattutto sotto forma di nanoparticelle, ed hanno composizioni chimiche disparate. Lenanoparticelle derivanti da diversi tipi di combustione e termodegradazione sono rituenutitra i componenti più potenti dell’inquinamneto dell’aria, e sono associate ad aumento dimorbidità cardiovascolare e morte per ischemia miocardica, aritmia e infarto (32). Infatti,diversi studi epidemiologici hanno dimostrato che l’aumento delle concentrazioni diparticolato atmosferico sono legate ad un aumento di morbidità e mortalità a brevetermine.La fonte principale delle nanoparticelle prodotte in modo non intenzionale e presentinell’inquinamento atmosferico varia a seconda delle regioni e dei fattori ambientali. Ingenere, nella maggior parte di regioni urbane, le emissioni dei veicoli di trasporto sono lafonte maggiore di particolato nanometrico (10).Le nanoparticelle presenti nell’atmosfera possono essere classificate come i) primarie e ii)secondarie.i) Le nanoparticelle primarie vengono emesse da fonti naturali (incendi, vulcani, erosione)o antropogeniche (motori a combustione, esplosioni, inceneritori, diversi processiindustriali).ii) Le nanoparticelle secondarie si formano nell’aria attraverso conversioni di gas inparticelle. Subito dopo la nucelazione, le nanoaprticelle sono molt piccole (1-10 nm), ecrescono per coagulazione o condenzano in particelle sub-micrometriche. La nucleazioneomogenea, con la formazione di particelle piccolissime, si può ottenere dalla combustionedi gas at alta temperatura ed in processi metallurgici.La regolamentazione esistene prevede il controllo e la limitazione dell’emissionenell’atmosfera di particelle di dimensioni inferiori ai 10 micron (PM10) e 2,5 micron (PM2.5),ma studi scientifici dimostrano che gli effetti nocivi del particolato atmosferico siano inrealtà dovuti maggiormente alla frazione più sottile (<2.5 micron). Inoltre, lenanoparticelle con diametro inferiore ai 100 nanometri (PM0.1), anche se in termini di 9
  • 15. massa rappresentano la minoranza delle particelle, in termini di numero sono certamentele più abbondanti tra il materiale particolato.Spesso le particelle ultrafini non si presentano disperse nell’aria, ma come aggregati cheritengono le proprietà tossiche delle singole nanoparticelle. La combustione di gasolio ebenzina causa la produzione di un aerosol che è principalmente di dimensioni nano. Duepicchi di nanoparticelle sono stati identificati in uno studio sulla composizione delleemissioni da combustione di gasolio: un picco di 30 nm (nanogoccioline, che fungono danuclei di accumulazione) ed uno di 80 nm. La composizione chimica delle nanogocciolineorganiche comprende idrocarburi C13-C35 (aldeidi, chetoni, ecc), idrocarburi policicliciaromatici e nitro-idrocarburi policiclici aromatici. I livelli di base delle nanoparticelleambientali sono nel range tra i 5,000 e 10,000 particelle per centrimetro cubico, valoreche può raggiungere i 3,000,000 durante episodi di inquinamento (55).L’inalazione è la via di esposizione più significativa per le nanoparticelle presenti nell’aria.Le particelle che entrano nell’organismo per questa via possono passare nella circolazionesanguigna nel giro di 1 minuto (35), e raggiungere tutti gli organi interni. 10
  • 16. 1.3 PROPRIETA’ DEI NANOMATERIALILe proprietà particolari dei nanomateriali sono dovute al fatto che, per le loro dimensioni,seguono leggi fisiche che si trovano tra la fisica classica e la fisica quantistica. Infatti, ilrapporto superficie/volume è molto elevato, a mezza via tra quello degli atomi e quello dimateriali di dimensioni oltre il micron. Per esempio, una nanoparticella sferica con unraggio di 2.5 nm e una densità di 5 g/cm3 ha una superficie di 240 m2/g, e ben il 20% degliatomi della particella si trovano sulla superficie (per una review: (4). E’ da considerare,comunque, che le superfici delle nanoparticelle non sono “nude”. Infatti, a causa delleforze adesive in superficie, le particelle spesso formano agglomerati, legandosi allasuperficie disponibile più vicina. Le caratteristiche che consentono di variare le proprietàdei nanomateriali sono essenzialmente la composizione, la dimensione e la superficie:-Dimensione: a seconda del materiale utilizzato per produrre le nanoparticelle, variando ledimensioni della nanoparticella si possono modificare proprietà quali solubilità,trasparenza, colore, lunghezza d’onda di assorbimento o emissione, conduttività, punto difusione e comportamento catalitico.-Composizione: composizioni chimiche differenti portano a comportamenti fisici e chimicidiversi.-Superficie: differenti proprietà di superficie portano a diversa capacità di dispersione,conduttività, comportamento catalitico e propiretà ottiche. Il legame di peptidi o altremolecole alla superficie di nanomateriali (“funzionalizzazione”), consente di diminuirel’aggregazione, oppure di rendere selettivo il legame con altri materiali o cellule.Tutti questi parametri devono essere controllati quando si pensa alla all’ applicazionetecnica di nanomateriali. Se non è possibile controllare le proprietà di superficie di unnanomateriale, questo forma aggregati, perdendo le caratteristiche che sono rpoprie delladimensione nanomolecolare. 11
  • 17. D’altro canto, sembra che anche gli effetti indesiderati dei nanomateriali siano dovuti aqueste stesse caratteristiche che li rendono interessanti, guidate da un’ampia superficieed elevata reattività superficiale (3).Molti studi hanno inoltre dimostrato che le modificazioni della carica di superficieinfluenzano grandemente le risposte biologiche alle nanoparticelle, quali fagocitosi,genotossicità e infiammazione. 12
  • 18. 1.3.1 Metodi di valutazione delle proprietà superficialiSiccome le applicazioni tecniche dei nanomateriali dipendono grandemente dalle loroproprietà di superficie, sono stati sviluppati diversi metodi per analizzare le caratteristichesuperficiali dei nanomateriali:-Potenziale zeta: è una funzione della carica di superficie della particella, dello stratoadsorbito sulla superficie, della composizione e natura del liquido in cui è sospesa lananoparticella. Di solito ha lo stesso segno del potenziale alla superficie della particella, edè misurabile soltanto sperimentalmente. Il potenziale zeta riflette la carica effettiva sullaparticella ed è perciò legato alla repulsione elettrostatica. Viene comunemente utilizzatoper lo studio di dispersioni di nanoparticelle, e dà una misura della loro aggregazione.-Secondary ion mass spectroscopy (SIMS): è un metodo distruttivo che dà informazionisulla composizione atomica degli strati da 1-3 nm con una risoluzione laterale elevata.SIMS ed altri metodi simili, però, possno dare informazioni soltanto sulla composizioneelemtare di un materiale, e non su proprietà chimiche come la reattività e lo stato dilegame degli elementi prossimi alla superficie.-X-ray photoelectron spectroscopy (ESCA): la spettroscopia elettronica per l’analisi chimica(ESCA) è un metodo non ditruttivo utilizzato per misurare la composizione atomica deglistrati tra 1-10nm, con scarsa risoluzione laterale. Perciò, è un metodo eccellente percaratterizzare la composizione chimica dei nanomateriali. ESCA, oltre a dare informazionisulla composizione chimica di un nanomateriale, serve anche per analizzare lo stato dilegame di elementi diversi.-Termogravimetria: le molecole di superficie vengono rimosse dal nanomaterialeriscaldandolo lenamente e misurando il cambiamento di peso. In contemporanea, siutilizza la spettroscopia di massa per determinare la natura elementare della molecola chesi è staccata dalla superficie. La combinazione delle due tecniche permette di valutare conprecisione il legame superficiale a molecole.-Microscopia a forza atomica (AFM) e scanning tunneling microscopy (STM): queste duetecniche si basano sull’utilizzo di un ago sottilissimo che scansiona una superficie, e 13
  • 19. possono essere controllate con una risoluzione inferiore all’atomo. Sono metodi moltopotenti per misurare la struttura e topografia di nanmoateriali e, in combinazione amiscroscopia a forza chimica, possono essere utilizzate per identificare singole molecolepresenti sulla superficie.-Reattività superficiale: sono stati sviluppati alcuini metodi più semplici per determinare lareattività superficiale delle nanoparticelle, come la misura dello svolgimento di DNAplasmidico o ossidazione del DNA del timo di vitello (12, 23). La risonanza paramagneticadi elettrone (EPR), in combinazione con lo spin-trap, è stata utilizzata per determinare lacapacità di generare radicali. Gli studi di EPR hanno mostrato una associazione positiva tratossicià in vitro e tossicità in vivo (23, 50, 56). Inoltre, il metodo di EPR ha consentito didimostrare che i fullereni sono in gradi di causare la produzione di radicali di ossigeno (6,57). 14
  • 20. 1.4 APPLICAZIONI DEI NANOMATERIALII nanomateriali, indipendentemente dalla loro natura (metalli, ceramiche, polimeri,materiali compositi), esibiscono proprietà inaspettate e, a volte, sorprendenti seconfrontate con quelle dei materiali convenzionali proprio a causa delle dimensioni deipropri costituenti. Negli ultimi venti anni i nanomateriali sono stati oggetto di intensostudio nei campi più disparati tanto che le moderne nanotecnologie ci mettono oggi adisposizione nanomateriali che possiedono proprietà magnetiche, ottiche, elettriche,meccaniche e catalitiche estremamente migliorate, da un punto di vista tecnologico-applicativo, rispetto a quelle dei materiali convenzionali.Ad oggi, si contano sul mercato 800 prodotti che provengono dalla nanotecnologia, di cuiil 60% sono cosmetici, ed il 10% sono in alimenti e supplementi (52).Tabella 1:Proprietà ed applicazionidei materiali nanotecnologici 15
  • 21. 1.4.1 Applicazioni biomedicheNegli ultimi anni, molti sforzi sia economici che intellettuali si sono rivolti alle possibiliapplicazioni dei nanomateriali in ambito biomedico (di qui il termine nanobiomateriali). Inparticolare, si è notato che l’eccezionale capacità di identificazione delle biomolecole,associata alle singolari proprietà dei nanomateriali possono portare alla creazione di nuovie migliorati tessuti biologici artificiali, a innovativi dispositivi elettronici basati su strutturebiologiche quali i biosensori, a sistemi diagnostici estremamente sofisticati e a nuovisistemi per la somministrazione di farmaci.Alcune delle applicazioni dei nanomateriali in medicina sono le seguenti:-Marcatori biologici fluorescenti-Drug e gene delivery-Bio-determinazione di patogeni-Riconoscimeto di proteine-Sonde per la struttura del DNA-Ingegnerizzazione di tessuti-Distruzione di tumori con ipertermia-Separazione e purificazione di molecole biologiche e cellule-Miglioramento di liquidi di contrasto per MRI-Studi di cinetica della fagocitosiIn questo contesto, i nanomateriali possono essere suddivisi in tre categorie principali, aseconda della geometria dei costituenti: a) sferici, b) monodimensionali o fibrosi e c)bidimensionali o lamellari. Una tabella riassuntiva di alcuni tipi di applicazione deinanomateriali in ambito biomedico, suddivisi per forma geometrica, sono riportati inTabella 2.Inoltre, sempre in ambito biomedico, sono attualmente in fase di studio nanoricoprimenti,nanofilm e superfici nanostrutturate realizzate con diverse tecniche di deposizione e 16
  • 22. modificazione superficiale. Particolarmente promettente sembra essere il settore deitessuti e degli impianti artificiali dove i nanomateriali vengono impiegati nellarigenerazione o nella sostituzione di vari tessuti biologici quali ossa, cartilagini, sistemivascolari e neurali.Nanomateriali Applicazioni biomedichea) sfericinanoparticelle di oro diagnostica e cura dei tumorinanoparticelle di platino catalizzatorinanoparticelle di ossido di titanio pigmenti, creme solari, ricoprimenti ortopedicidendrimeri sistemi per la somministrazione di farmaciquantum dots diodi laser, biosensorib) monodimensionali o fibrosinanotubi e nanofibre di carbonio conduttori, dispensatori di farmacinanofibre di ossido di alluminio filtri di aria e acqua altamente efficientic) bidimensionali o lamellari rinforzante di polimerinanoplacche di grafite impianti ortopedici e dispensatori di farmaci innano-idrossiapatite ortopediaTabella 2: Applicazioni biomediche di nanomateriali, classificati in base alla formatridimenzionale. 17
  • 23. Nanoparticelle metalliche possono formare il core del nanomateriale, che vienefunzionalizzato in superficie mediante il legame di materiali inorganici o polimerici cherendono selettivo il riconoscimento di molecole o cellule target. Nanoparticella di Au (13 nm) funzionaizzata con oligonucleotidi, farmaci o peptidiI quantum dots, che trovano applicazione come biomarkers, hanno la caratteristica diassorbire ed emettere luce ad una specifica lunchezza d’onda, a seconda della dimensionedella particella. Quantum dots di diverse dimensioni 18
  • 24. Nanovescicole o nanotubi, invece, sono composti da carbonio e metalli, e formano cavitàche possono essere riempiti con farmca, enzimi o marcatori, e funzionalizzateesternamente con molecole che ne conferiscano la specificità di target. Nanovescole,nanotubi e nanosensori trovano applicazione in drug delivery, gene delivery, diagnostica ericerca di base. Nanocapsula per il trasporto selettivo di DNA, farmaci, marcatori o oligonucleotidi Nanosensore molecolare Nanotubo single-wall funzionalizzato con peptidi1.5 NANOTOSSICOLOGIA 19
  • 25. Nonostante le nanotecnologie promettano benefici enormi per la società e grossi capitalisiano sempre più investiti in questa nuova tecnologia, e nonostante oggi ci siano circa 800prodotti nanotecnologici sul mercato (di cui il 60% cosmetici e 10% alimentari), restaancora da definire se/quali nanomateriali ingegnerizzati sino dannosi per la salutedell’uomo e/o per l’ambiente (52). Non essendo chiari i meccanismi che rendono inanomateriali così fisicamente e chimicamente unici, è ancora impossibile predire il lorocomportamento a contatto con diversi sistemi biologici. Convinzione comune tra itossicologi è che i nanomateriali, avendo proprietà fisiche e chimiche così diverse daglistessi materiali nelle dimensioni atomiche o super-micrometriche, abbiano bisogno diessere testati e regolamentati in modo specifico. Nonostante ciò, a tutt’oggi non esistonotest standard che siano universalmente riconosciuti per classificare la tossicità di unnanomateriale, e proprio per questo scopo è nata una nuova branca della scienza,nell’incontro tra la nanotecnologia e la tossicologia: la nanotossicologia.L’impossibilità di definire il rischio legato alla nanotecnologia, dovuto all’assenza diprotocolli standard per la valutazione tossicologica dei nanomateriali, rischia di rallentarel’avanzamento della nanotecnologia a causa del principio precauzionale o per paura diinvestimenti a rischio. In questo scenario, la nanotossicologia si pone come una brancafondamentale per la nanotecnologia.Da un punto di vista tossicologico, possiamo dividere i nanomateriali provenienti dacombustione in modo naturale o non intenzionale, presenti sottoforma di inquinantiambientali, dai nanomateriali progettati e prodotti dalla nanotecnologia (Tabella 2,paragrafo precedente). Questi due gruppi sono differenti sia dal punto di vistadell’esposizione, che dal punto di vista chimico. L’esposizione a nanomateriali che sonoprodotti non intenzionalmente è meno controllabile/prevedibile, rispetto all’esposizinedei nanomateriali che vengono prodotti dall’industria, ai quali sono esposte classi piùristrette di persone (dal punto di vista di età, sesso, stato di salute), per esempio ilavoratori durante la produzione o il trasporto. Inoltre, da un punto di vista chimico: inanomateriali presenti nell’inquinamento ambientale sono un insieme chimicamentecomplesso di natura polidispersa (diversi composti di carbonio volatili solubili, mescolati a 20
  • 26. composti inorganici poco solubili), mentre i nanomateriali ingegnerizzati sono soluzionimonodisperse di solidi a composizione chimica conosciuta, generati in gas o fase liquida.Nonstante queste differenze, si suppone che gli stessi prinicipi tossicologici sianoapplicabili ad entrambe le classi di nanomateriali. 21
  • 27. 1.5.1 Biocinetica delle nanoparticelleL’esposizione ai nanomateriali può avvenire attraverso atmosfera, cibo, acqua, prodottiper la cosmesi e dentifrici, contatto con i tessuti di abbigliamento e la somministrazione difarmaci.In teoria, i nanomateriali presenti nei prodotti cosmetici e dentifrici possono entrarenell’organismo per assorbimento dermico. In pratica, l’assorbimento oltre lo strato dellasottomucosa non è ancora stato dimostrato, e nessuno studio è ancora riuscito a dare unarisposta al dubbio riguardante l’assorbimento cutaneo di nanoparticelle.I nanomateriali presenti nell’aria si depositano, per inalazione, lungo tutto il trattorespitarorio (naso, trachea-bronchi, alveoli, a seconda delle dimensioni del particolato). E’stato dimostrato che, per inalazione, le nanoparticelle passano dai polmini al circolosanguigno entro un minuto nell’uomo, per andare a depositarsi in diversi organi interni(35). Molti altri studi, condotti su animali, hanno confermato che le nanoparticelle inalatepossno raggiungere tutti gli organi interni (26, 42, 51). Inoltre, possono passare attraversola mucosa nasale ed entrare nel cervello (41). WG Kreyling et al. hanno condottorecentemente uno dei primi studi sistematici di analisi biocinetica delle nanoparticelle,misurando l’accumulo in organi primari e secondari dopo inalazione (25). Dopoinstillazione tracheale, gli autori hanno visto una traslocazione sistemica del 10% delle 192nanoparticelle di Ir, ed un accumulo persistente in organo secondari. Hanno inoltreosservato che la traslocazione dipense dal tipo di nanoparticella (192Ir > carbone) e dalledimensioni (Ir: 20>80 nm; oro: 1.4>18 nm), ma anche dalla la carica delle nanoparticelleinalate.Le nanoparticelle presenti nel cibo (17) e nell’acqua entrano nell’oranismo per ingestione.Attravero l’intestino possono essere eliminate, oppure la parete intestinale le puòassorbire e far passare nel circolo sanguigno o linfatico.Attraverso la via parenterale, i nanomateriali presenti nelle preparazione di farmaci obiomarker diagnostici, entrano direttamente nella circolazione sanguigna e possonoraggiungere ogni organo. La velocità ed il tipo di organo colpito dipende dallecaratteristiche del nanomateriale, e possono essere diversi per diverse nanoparticelle. 22
  • 28. Kreying et al. hanno dimostrato che l’uptake da parte del sistema mononuclearefagocitario dipende dalle dimensioni delle nanoparticelle (200 > 1.4 nm) (reviewed in(52)).Figura da (40)Alcuni nanomateriali possono essere eliminati tramite urine, feci, sudore o passare nellatte materno. Le nanoparticelle non solubili, invece, possono accumularsi nei polmoni,intestino e cervello, rene, fegato e rimanere per anni. In questi tessuti, non essendo unattivo uptake da parte dei macrofagi, i nanomateriali interagiscono con celluledell’epitelio, tessuto interstiziale e cellule endoteliali, scatenando risposte infiammatorie. 23
  • 29. 1.5.2 Interazione dei nanomateriali con il sistema reticolo-endotelialeIl sistema reticolo-endoteliale è costituito da cellule in grado di fagocitare debris cellulare,cellule invecchiate, patogeni e sostanze estranee come particelle inerti che circolano nelsnague. Queste cellule comprendono macrofagi, monociti e cellule endotelialispecializzate che ricoprono organi come fegato, milza e midollo osseo. Il sistema reticolo-endoteliale presente nel fegato entra in contatto con tutte le nanoparticelle che vengonoassorbite dal tratto grastro-intestinale e, passando attraverso il circolo portale, arrivano alfegato. La funzione principale di questo sistema è di rimuovere e neutralizzare ognipotenziale patogeno che entra in circolazione dopo essere stato assorbito dalla microfloraintestinale. Le conseguenze dell’uptake delle nanoparticelle che derivano dall’intestino daparte dei macrofagi non è ancora chiaro. Alcuni studi hanno mostrato che nanoparticellepoco tossiche come carbon black e polistirene sono in grado di stimolare i macrofagiattraverso produzione di radicali liberi e attivazione del signailing del calcio. Il risultato è laproduzione di citochine infiammatorie come tumor necrosis factor (7). Lo stressossidativo, così indotto, può inibire la funzionalità delle cellule epatiche e la formazionedella bile (54), mentre le citochine pro-infiammatorie sono associate a malattia epatica.1.5.3 Nanoparticelle e induzione della reazione infiammatoriaSono stati proposti diversi meccanismi per cui le nanoparticelle causano una rispostainfiammatoria. Gli elementi scatenanti sarebbero dovuti alla maggiore area superficialedelle nanoparticelle rispetto a materiali più voluminosi, oppure alla presenza dicomponenti solubili rilasciati dalle nanoparticelle, come composti organici e metalli (1, 27,37).Le sostanze organiche associate al particolato che deriva dalle emissioni di combustione digasolio sono soprattutto benzene e idrocarburi policiclici aromatici, e causano il rilascio dicitochine e fattori di crescita come interleukin-8 (IL-8), IL-1beta, granulocyte macrophagecolony-stimulating factor (GM-CSF) in colture di cellule epiteliali (2, 21). 24
  • 30. I metalli associati al nanoparticolato atmosferico sono responsabili di stress ossidativo alivello cellulare (11, 53), ed agiscono sinergisticamente con la superficie dellananoparticella.Figurada (4)In generale, gli studi hanno identificato cambiamenti nell’espressione genica e nel cellsignaling dovuti a stress ossidativo, come principali fattori di tossicità dovuta al contattocon nanoparticelle, e alla presenza di metalli di transizione e composti organici associati ananoparticelle atmosferiche. Gli effetti erano di solito più amplificati per le nanoparticellerispetto a particelle fini, anche se per il particolato atmosferico, a volte era vero il 25
  • 31. contrario. L’interèpretazione di studi in vitro è a volte resa difficile dal fatto che venganoutilizzate particelle di composizione chimica differente, oppure diversi tipi cellulari, diverseesposizioni e dosi.Modello di interazione tra cellula e nanoparticella da (40).1.5.4 Tossicità polmonare dei nanomaterialiStudi di tossicità sui ratti hanno dimostrato che le nanoparticelle causano risposteinfiammatorie più accentuate rispetto a particelle della stessa composizione chimica ma divolume maggiore (13, 39). Sia l’area superficiale che il numero di particelle inalatesembrano giocare un ruolo importante nella tossicità polmonare. Un ulteriore elemento ditossicità delle nanoparticelle sta nella velocità di deposizione che dipende dalladimensione del particolato, che è maggiore nel caso di particelle disperse piuttosto cheaggregate. Gli studi citati suggeriscono come le nanoparticelle inalate, dopo essersi 26
  • 32. depositate nel polmone, eludeno il controllo dei macrofagi alveolari e riescano adinfiltrarsi nello spazio interstiziale, mediante traslocazione dagli spazi alveolari attraversol’epitelio (4).I fattori che si pensa influenzino maggiormente la tossicità polmonare dei nanomaterialisono: 1) numero e dimensioni delle nanoparticelle 2) coating superficiale 3) grado di aggregazione/agglomerazione 4) cariche superficiali 5) metodo di sintesiIn teoria, le nanoparticelle aggregate possono anche disgregarsi, a contatto con liquidiparticolari. Il grado di aggregazione o disgregazione delle nanoparticelle al momentodell’inalazione, o nelle fasi di deposizione nel tratto respiratorio, influisce grandementesulle interazioni con le cellule polmonari. Infatti, se le aggregati nanoparticelle sidisgregano durante l’interazione con i fluidi alveolari, possono comportarsi comenanoparticelle singole e traslocare agli organi interni.Studi di tossicologia su nanoparticelle fibrose hanno dimostrato che fibre naturali (comel’amianto) e costruite dall’uomo sono associate a elevato rischio di fibrosi e cancropolmonare (19). I parametri critici sono: dose, dimensione e durabilità delle fibre. Le fibresono, per definizione, di struttura allungata con un rapporto diametro:lunghezza (aspectratio) di 3:1 o maggiore, e con una lunghezza maggiore a 5 micrometri e diametroinferiore ai 3 micrometri. I nanotubi di carbonio hanno un aspect ratio maggiore di 100, ela lunghezza può eccedere i 5 micrometri con diametri da 0.7 a 1,5 nm per nanotubi asingola parete (singel-walled nanotubes), e da 2 a 50 per i nanotubi a pareti multiple(multiwalled nanotubes). 27
  • 33. 1.5.5 Tossicità cardio-vascolare delle nanoparticelleLa maggior parte dei dati sulla tossicità delle nanoparticelle derivano da studi sui PM10, dacui si sono formulate ipotesi che vengono applicate a tute i nanomateriali. Studiepidemiologici sugli effetti cardiovascolari della porzione ultrafine del particolatoambientale hanno portato alla formulazione di ipotesi sui meccanismi del danno cheprovoca infarto miocardico (43, 44, 59) o mortalità (16, 31, 47, 59, 61), come descritto inFigura (14).Meccanismi di tossicità delle nanoparticelle ambientali inalate (PM) sull’apparato cardio-circolatorio. ET:endotelio, MI: infarto miocardico, NO: ossido nitrico, TF: fattore tissutale.Da (14).Secondo una ipotesi che è stata formulata recentemente, un fattore importante alla basedel danno cardiovascolare sarebbe attribuibile alla risposta infiammatoria che si scaternaal contatto con le particelle ultrafini ambientali. L’infiammazione polmonare causerebbe 28
  • 34. un rilascio di radicali liberi, citochine e chemochine nella circolazione sanguigna (15), cheagiscono negativamente sulla funzionalità cardiaca. Infatti, in pazienti affetti da malattiacoronarica ed esposti a diverse frazioni del particolato ambientale, è stato visto unaumento di proteina C reattiva ed un’aumentata coagulazione del sangue (49). Incocnlusione, si pensa che la frazione particolata dell’inquinamento atmosferico sia unfattore di rischio di mortalità per malattia cardio-vascolare attravero meccanismi diinfiammazione, arterosclerosi accelerata e funzione autonomica accelerata (48, 60).1.5.6 Tossicità delle nanopartielle nel sistema nervoso centraleLe nanoparticelle inalate possono accedere al sistema nervoso centrale (CNS) (26, 51), percontatto con l’epitelio nasale e risalendo per trasporto trans-sinaptico dei nervi olfattivifino al bulbo olfattivo (41).Inoltre, i nanomateriali che circolano nel sangue possono entrare nel CNS attraverso ilsuperamento della barriera emato-encefalica. Nonostante questa sia una barrieraaltamente selettiva, e consenta il passaggio soltanto per via trans-cellulare, in moltepatologie, come ipertensione ed encefalomielite allergica, la permeabilità della barrieraemato-encefalica risulta diminuita e fa passare nanoparticelle, come dimostrato in alcunimodelli. E’ stato inoltre dimostrato che la carica superficiale delle nanoparticelle puòalterare l’intergrità della barriera ematoencefalica, con possibili conseguenze sugliimpeghi dei nanomateriali per drug delivery nel CNS (24, 33), ma anche sulla tossicità nelcervello (28).L’utilizzo di nanoparticelle paramagnetiche di magnetite (ossido di ferro Fe3O4) si èdimostrato sperimentalmente interessante (20), e si pensa che potrà essere applicato aitrapianti, per seguire il destino delle cellule staminali introdotte per curare malattiedegenerative. La tossicità di un utilizzo del genere, però. Rimane ancora del tuttosconosciuto. Non si sa ancora pressochè nulla, infatti, sulla tossicologia dei nanomaterialinel cervello. E’ stato dimostrato che le nanoparticelle inducono stress ossidativo, e propriolo stress ossidativo è uno dei fattori implicati in malattie neurodegenerative comeParkinson’s disease e Alzheimer’s disease (22). Uno studio del 2004 ha suggerito 29
  • 35. un’associazione tra nanoparticelle presenti nel cervello e l’aumento dei markerdell’infiammazione e accumulazione di AB42 nella corteccia frontale ed ippocampo dipersone che avevano sviluppato malattia di Alzheimer (8). Infine, in topi è stato mostrataun’attivazione delle citochine pro-infiammatorie nel cervello in seguito ad inalazione diparticolato (9). 30
  • 36. 1.6 EMATOPOIESIL’emopoiesi, ovvero la formazione di tutte le cellule del sangue, avviene nel midollo osseopartendo dalle cellule staminali (stem cells) ematopoietiche residenti, che esprimono sullaloro superficie la proteina di cluster differentiation CD34+. Queste cellule CD34+ si trovanoin uno stato quiescente e pronte, in seguito a particolari stimoli, a duplicarsi (self-renewal)oppure ad entrare nella via differenziativa verso una delle linee ematopoietiche. + CD34 Lymphoid Stem Cell + CD34Pluripotent Stem Cell + CD34 Myeloid Stem Cell 31
  • 37. Quando la cellula staminale ematopoietica riceve un segnale di differenziamento, essapuò diventare un progenitore linfoide oppure un progenitore mieloide. Dal progenitorelinfoide, in risposta a specifici segnali differenziativi e proliferativi, si generanno iprecursori di tutti i linfociti, sia di tipo B che T. Questi poi entrano nel sangue e vanno aproliferare e maturare in organi linfoidi secondari, come linfonodi, timo e milza. Iprogenitori mieloidi, invece, danno origine a eritrociti, granulociti (eosinofili, basofili,neutrofili), monociti-macrofagi e trombociti.1.6.1 Saggio di proliferazione e differenziamento dei progenitori ematopoietici (CFUassay)Una CFU (colony forming unit), o CFC (colony forming cell), è una cellula in grado direplicarsi e differenziarsi, dando origine ad una intera colonia di cellule. La scoperta che lecellule precursori ematopoietici hanno la capacità di formare colonie risale a più di 40 annifa (5, 46), ed ha rivoluzionato l’ematologia da un punto di vista sperimentale, diagnosticoe terapeutico. Da allora, la conoscenza dei meccanismi di proliferazione edifferenziamento dei precursori ematopoietici ha fatto passi da gigante. Questa scopertaha permesso di delineare meccanismi di fisiologia e patologia dello sviluppo di questecellule, portando all’utilizzo di citochine ematopoietiche nella pratica clinica esperimentale. Inoltre, sono stati sviluppati metodi per stimare il numero di celluleprogenitrici, da una sospensione di cellule miste (per esempio sangue o aspiratomidollare).Il saggio di proliferazione e differenziamto delle CFU (CFU assay) riproduce gli ultimi stadidell’ematopoiesi mieloide in coltura a breve termine, e richiede 14 giorni di coltura interreno semisolido. Per studiare gli stadi primitivi dell’ematopoiesi sono invece necessariecolture a lungo termine (almeno 7 settimane), divise in 2 o 3 diversi passaggi, e richiedonoalmeno un passaggio di incubazione su un feeder layer di cellule di supporto. Le cellulestaminali pluripotenti, infine, possono essere testate soltanto in modelli animali, in cuiqueste cellule sono in grado di ripopolare un midollo osseo precedentemente ablato. 32
  • 38. I precursori che formano colonie in 14 giorni rappresentano uno stadio intermerdio tracellule staminali pluripotenti in grado di ripopolare un midollo osseo e cellule concaratteristiche morfologiche di differenziamento. Il destino differenziativo (linecommitment) di queste cellule può essere determinato in vitro mediate il CFU Assay, checonsente ad ogni singolo progenitore mieloide di crescere e dare luogo ad una colonia,con il supporto di un terreno contenente un matrice semisolida (metilcellulosa, collageneo agar). Ogni colonia, in base alle caratteristiche morfologiche della colonia stessa o dellecellule che la compongono, può essere identificata come derivante da un progenitoreeritroide (BFU-E o CFU-E), granulocitico (CFU-G), monocitico (CFU-M) o megacariocitico(CFU-Meg). Si possono inoltre sviluppare colonie miste (CFU-GEMM, CFU-GM).I precursori delle diverse line differenziative hanno bisogno della presenza di diversi fattoridi crescita, che vengono aggiunti al terreno all’inizio della coltura. I fattori di crescita piùutilizzati sono:-Eritropoietina: Epo è indispenzabile per la sintesi dell’emoglobina in vivo ed in vitro.-Stem Cell Factor: SCF ha una forte azione stimolante, non fisiologica. Spinge verso ildifferenziamento eritroide, a discapito della linea neutrofila, probabilmente a causa deisuoi effetti antiapoptotici sui precursori eritroidi, e stimola eosinofili e basofili.-Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating Factor: GM-SCF ha un’azione stimolante perdiverse line: CFU-M, CFU-Eo (precursori eosinofili), BFU-E (burst forming unit-erythoid) interreno contenetne Epo e crescita di macrofagi singoli parsi. E’ uno stimolatore debole diCFU-G.-Granulocyte Colony-Stimulating factor: G-CSF, nonstante il nome, non stimola molto iCFU-G, ma soprattutto agisce sui BFU-E in terreno contenente Epo.-Interleuchina-3: IL-3 stimola CFU-M, CFU-Eo e soprattutto BFU-E in terreo contenenteEpo. Stimola debolmente CFU-G. 33
  • 39. 34
  • 40. 1.7 SCELTA DELLE NANOPARTICELLE E DEL MODELLO CELLULARE1.7.1 La scelta delle nanoparticelleLe nanoparticelle che abbiamo deciso di testare hanno un interesse nel settore dellananotossicologia ambientale e della nanotecnologia. Infatti, le nanoparticelle di TiO2, Au,Ag e Fe3O4, Fe2O3 vengono prodotte dalla nanotecnoloiga e sono già presenti incommercio in diversi prodotti, mentre quelle di Sb2O3, e Co sono presenti nell’ambientecome prodotti di degradazione ed inquinanti.-nanoparticelle di TiO2: Il diossido di titanio è molto resistente, leggero, resitente allacorrosione anche in condizioni chimiche drastiche, ha un’elevata attività fotocatalitica edun costo relativamente basso. Viene usato principalmente come pigmento bianco nellevernici, nelle materie plastiche e nel cemento da costruzione e come opacizzante per levernici colorate; per tale ragione, viene anche comunemente “bianco di titanio”. Esso hasostituito i pigmenti usati precedentemente, quali il bianco di piombo, il solfato di bario eil solfato di calcio. E’ usato anche come carica nelle materie plastiche e nella gomma,come opacizzante nella carta e nelle fibre tessili e mei materiali ceramici per aumentare laresistenza agli acidi. Il TiO2 viene utilizzato in medicina per costruire protesi articolari, dacui per usura vengono rilasciate nanoparticelle di questo materiale. Si stanno inoltrestudiando materiali avvolti da una pellicola di TiO2 nanoporosa per aumentare l’adesionedi cellule nelle protesi dentali. Inoltre, le nanoparticelle di titanio vengono usate inprodotti per alimenti e in cosmetici, soprattutto nelle lozioni solari per le proprietà di filtriUV. E’ classificato come non tossico, ma sono stati riportati effetti infiammatori a livellopolmonare quando nanostrutture di rutilio (TiO2) vengono instillati nella trache di ratti(36).-nanoparticelle di Au: Le nanoparticelle d’oro vengono prodotte con facilità ed incondizioni blande per riduzione chimica di Sali di oro. Le dimensioni in questo casopossono essere molto ridotte (anche inferiori al nanometro) e le dispersioni molto piccole.Le nanoparticelle d’oro oissiedono, come altri tipi di particelle metalliche, particolariproprietà di assorbimento della luce visibile (assorbimento plasmonico) che le rendonoparticolarmente adatte allo sviluppo di test diagnostici, alcuni dei quali già 35
  • 41. commercializzati. Un’altra importante caratteristica è la possibilità di assemblare sulla lorosuperficie un monostrato ordinato di molecole organiche dotate di gruppi funzionali tiolici:questa proprietà potrà consentire lo sviluppo di diverse applicazioni sia nel campo dellacatalisi che del trasporto di farmaci. Infine, nanoparticelle d’oro sono presenti in alcuniproditti cosmetici e lubrificanti.-nanoparticelle di Ag: accanto alle nanoparticelle d’oro, anche le nanoparticelle di argento,del tutto simili per modalità di preparazione e proprietà, stanno attraendo una notevoleattenzione per le loro proprietà antibatteriche e sono presenti in motli porodotti di orinigediversa, come per esempio tessuti per abbigliamento sportivo.-nanoparticelle di Fe3O4: le nanoparticelle di magnetite possono essere preparate confacilità per riduzione chimica di Sali di ferro e sono molto studiate per le particolariproprietà magnetiche, che le rendono estremamente interessanti per le applicazioni ditipo biomedicale. Esse infatti possono essere “spostate” con campi magnetici esterni equesto rende possibile sia il loro recupero (ad esempio per isolare determinati compostida matrici complesse a scopo diagnostico) hce il loro direzionamento (per concnetrare leparticelle nel tessuto biologico di interesse). Questo tipo di particelle sono oggetto digrande attenzione anche come agenti di contrasto per la risonanza magnetica nucleare eper il trattamento terapeutico con la tecnica dell’ipertemia. In questo caso, l’esposizionedel tessuto biologico contenente le particelle ad un campo magnetico oscillante provoca ilriscaldamento del tessuto e quindi la morte delle celule che lo costituiscono. Allo statoattuale, non sono ancora disponibili prodotti commerciali per questo tipo di nanosistemi.Un’ ulteriore applicazione delle nanoparticelle di Fe3O4 è nella pulizia delle acquecontaminate da arsenico (58). Il meccanismo è mostrato nella figura successiva. 36
  • 42. Nanoparticella di Fe3O4 (in rosso) con attaccate delle molecole di acido oleico che leganomolecole di arsenico (in verde-blu). Le nanoparticelle, così cariche di arsenio, possono poiessere eliminate della soluzione con l’utilizzo di un piccolo magnete, trascinando vial’arsenico.-nanoparticelle di Fe2O3: L’applicazione potenziale di nanoparticelle di ematite èsoprattutto nella diagnostica medica. Per esmepio, potrebbero essere utilizzate comeagente di contrasto per risonanza magnetica e terapia tumorale con la tecnicadell’ipertermia indotta da campo magnetico. Il problema delle nanoparticelle di ematite,al momento, è la loro tendenza fortissima a formare aggregati, e si stanno sviluppandosistemi per rendere queste nanoparticelle più dispersibili in soluzioni acquose.-nanoparticelle di Sb2O3: l’ossido di antimonio è utilizzato come catalizzatore per laformazione di plastiche e per le proprietà ignifughe. Si trova in molti prodotti di usocomune, comprese bottiglie di plastica, computers, freni delle macchine. Nell’ambiente,nanoparticelle di Sb2O3 si trovano sottoforma di inquinanti, che escono dai camini degliinceneritori e vengono prodotti dall’usuara dei freni dei veicoli stradali. Insclusioni didimensioni nanometriche-micrometriche sono state ritrovate in biopsie di tessuti umanicolpiti da patologie di eziologia sconosciuta (non pubblicato). 37
  • 43. -nanoparticelle di Co: Le nanoparticelle di cobalto, come quelle di magnetite e di ematite,sono interessanti in nanotecnologia per le loro porporetà magnetiche, ed hannopotenziale utilizzo in medicina, come agenti di contrasto e terapia tumorale medianteipertermia. Ultimanente le nanopartcielle di Co sono risultate interessanti come migliorealternativa a quelle di ferro, a causa di migliori proprietà fisiche. Nanoparticelle di cobalto,inoltre, si trovano negli scarichi di inceneritori e si formano in seguito ad esplosioni adaltra tempoeratura, per esempio durante operazioni belliche. Queste sono state trovate intessuti patilogici di persone affette da malattie ad eziologia sconosciuta (non pubblicato).1.7.2 La scelta del modello cellulareQuando le nanoparticelle incontrano il corpo umano, esse entrano in contattoimmediatamente con i tessuti che formano la barriera con l’esterno, cioè epidermide,tessuto polmonare e tessuti dell’apparato gastro-intestinale, attraverso le vie che abbiamodescritto dei capitoli precedenti. Una volta entrate, interagiscono con il sangue e con lecellule che sono presenti nel sangue. I modelli di studio fin’ora sviluppati, per determinarela tossicità delle nanoparticelle a contatto con i tessuti biologici, si sono concentratisoprattutto sulle cellule del polmone o cellule epiteliali, mentre ancora poco è stato fattocon cellule del sangue.Esistono molte linee cellulari continue che derivano da cellule del sangue umano, lamaggior parte delle quali derivano da tumori. In tutti i casi, si tratta di cellule che hannoperso gran parte delle caratteristiche fenotipiche rispetto alle cellule sane da cui sonooriginariamente partite. Oltre ad essere state selezionate per la loro capacià di crescitavirtualmente illimitata, esse vengono utilizzzate in condizioni di laboratorio per anni,hanno attraversato diverse selezioni ed accumulato errori genomici ad ogni passaggio. Perquesti motivi, nonostante le linee cellulari continue restino uno strumento indispensabileper la biologia e la medicina, non bisogna dimenticare che la risposta di queste cellule aduno stimolo tossico può essere totalemtne diversa dalla risposta che una cellula in vivopuò dare allo stesso stimolo. 38
  • 44. Le colture di cellule primarie, seppur mantenendo i limiti dati dall’artificiosità della colturain vitro, è probabilmente un modello migliore per predire la tossicità di materiali come lenanoparticelle, e vengono sempre più scelte come sistema biologico dai laboratori ditossicologia. Le colture primarie vengono prodotte coltivando cellule prelevate da organiespiantati di animali, oppure da biopsie umane da donatori, e mantenute in coltura per unperiodo di poche settimane, limitando l’accumulo di aberrazioni.Per questo lavoro abbiamo scelto di creare colture primarie da cellulestaminali/progenitrici di midollo osseo umano. Questo modello ha una rilevanza inquanto, quando le nanoparticelle entrano nel sistema circolatorio, esse incontrano lecellule del sangue e possono esercitare un effetto tossico sia sulle cellule mature, che suiprogenitori circolanti. Inoltre, le nanoparticelle possono entrare nel midollo osseo dove lecellule progenitrici e staminali sono concentrate, ed avere effetti tossici a più lungotermine sulla funzionalità delle cellule del sangue.Le cellule staminali/progenitrici che abbiamo utilizzato sono state acquistate dalla StemCell Technologies, che le ha ottenute tramite aspirazione di midollo osseo da donatori saniinformati, in accordo con le linee guida etiche Americane. 39
  • 45. 2. SCOPO DELLA TESI 40
  • 46. Scopo della tesiNonostante le nanotecnologie promettano benefici enormi per la società e grossi capitalisiano sempre più investiti in questa nuova tecnologia, e nonostante oggi ci siano circa 800prodotti nanotecnologici sul mercato (di cui il 60% cosmetici e 10% alimentari), restaancora da definire se/quali nanomateriali ingegnerizzati o presenti nell’ambientesottoforma di inquinamento siano dannosi per la salute dell’uomo e/o per l’ambiente.Alcuni meccanismi e principi di tossicità sono stati ipotizzati utilizzando nanoparticelle enanofibre, ma è ancora impossibile predire il loro comportamento a contatto con diversisistemi biologici. Convinzione comune tra i tossicologi è che i nanomateriali, avendoproprietà fisiche e chimiche così diverse dagli stessi materiali nelle dimensioni atomiche osuper-micrometriche, abbiano bisogno di essere testati e regolamentati in modo specifico.Nonostante ciò, a tutt’oggi non esistono test standard che siano universalmentericonosciuti per classificare la tossicità di un nanomateriale.Lo scopo di questo lavoro è stato di definire la tossicità di alcune nanoparticelle che sitrovano nell’ambiente sottoforma di inquinanti (Co, Sb2O3, Fe2O3) oppure in prodottinanotecnologici (es. TiO2, Ag, Au, Fe3O4), in un sistema che, seppur con le limitazioni dellacoltura in vitro, potesse avvicinarsi il più possibile alla cellula umana in condizioni simili aquelle fisiologiche. Alcuni effetti tossici di nanomateriali su cellule sono già stati dimostratiin vitro, ma si tratta per lo più di studi compiuti su linee cellulari diverse ed i risultati nonsono spesso paragonabili. Le linee cellulari potrebbero non essere il modello migliore incui testare la nanotossicologia, in quanto sono costituite da cellule tumorali o trasformate,che si replicano continuamente in vitro. Questa continua replicazione, oltre a produrreerrori genomici che si sommano ad ogni passaggio di coltura, è dovuta al fatto che imeccanismi fondamentali della proliferazione e del differenziamento sono profondamentealterati in queste cellule. In primo luogo, quindi, ci siamo posti il problema del modellocellulare in cui testate la tossicità delle nanoparticelle. Abbiamo scelto di utilizzare celluleprogenitrici ematopoietiche, estratte dal midollo osseo di donatori sani. Abbiamo poiparagonato i risultati ottenuti in queste cellule, a risultati ottenuti in linee cellulari.Il secondo scopo del presente lavoro è stato di fornire i primi elementi per un’analisi dimeccanismi cellulari e di signaling della nanotossicità delle nanoparticelle di Sb2O3. 41
  • 47. 3. MATERIALI E METODI
  • 48. Materiali e Metodi3.1 CELLULE CD34+ DA MIDOLLO OSSEO UMANOLe cellule progenitrici CD34+ di midollo osseo da 9 donatori sani sono stati acquistate dallaStem Cell Technologies. Ogni campione conteneva cellule derivanti da un solo donatore,ed i 9 campioni provenivano da 9 donatori diversi. I campioni di midollo osseo venivanoprocessati dalla Stem Cell Technologies, che provvedeva ad estrarre le CD34+ medianteselezione positiva. Ogni campione era provvisto di un certificato di qualità, attestante lapurezza del preparato (almeno il 95% delle cellule erano CD34+). Le cellule ci sono arrivatecongelate, trasportate in ghiaccio secco e conservate in azoto liquido.3.2 NANOPARTICELLELe nanoparticelle di ossido di ferro (Fe3O4, diametro: 20-30 nm), ossido di ferro (Fe2O3,diametro: 55-65 nm), argento (Ag, diametro 90-210 nm), oro (Au, diametro: 50-100 nm),ossido di antimonio (Sb2O3, diametro: 41-91 nm) sono sate acquistate da Nanoamor. Lenanoparticelle di cobalto (Co, diametro 50-200 nm) sono state acquistate da FlukaChemical Corp. Le nanoparticelle de ossido di titanio (TiO2, diametro: 20-160 nm) sonostate acquistate da TAL Materials, Inc. Le nanoparticelle sono state pesate e depirogenatea 189oC per 90 minuti in tubi di vetro. Le nanoparticelle secche così sterilizzate sono staterisospese aggiungendo lentemnte terreno di coltura e immediataemtne agitate e sonicatea bagno per 15 minuti. Agitazione e sonicazione sono state ripetuti prima di ogni utlilizzodello stock risospeso.3.3 DINAMIC LIGHT SCATTERING (DLS)La caratterizzazione delle dispersioni di nanoparticelle in soluzione è stata ottenuta con latecnica del photon correlation spectroscopy, utilizzando un Zetasizer 3000 (MalvernInstruments). Le nanoparticelle secche sono state risposese in diversi terreni di coltura cheerano utlizzati nei diversi esperimenti. Il terreno semi-solido contenente metilcellulosanon rendeva possibile una lettura attendibile con questo strumento, ed è statosostituitocon Iscove Modified Dulbecco Medium (IMDM) con l’aggiunta di siero bovino fetale (FBS) 43
  • 49. Materiali e Metodial 30%. I campioni sono stati misurati 10 volte, e le misurazioni sono state fatte a 25oC conun angolo di 90°. I dati sono stati analizzati con il software Contin e sono mostrati comefunzione dell’intensità.3.4 CFU ASSAYLe cellule progenitrici CD34+ derivanti del midollo osseo e le cellule delle linee K562 e HL-60 sono state piastrate alla concentrazione di 500 cellule/ml in un terreno contenentemetilcellulosa (Metho-Cult, Stem Cell Technologies Inc., cataloghi numero H4535 e H4434)secondo procedure standard (38). Il terreno era composto da IMDM supplemtnetato conFBS al 30%, albumina serica bovina al 1%, 10-4 betamercaptoetanolo, 2mM L-glutamminae diverse combinazioni di fattori di crescita. Per il saggio delle colonyu forming unit-granulociti (CFU-G), -macrofagi (CFU-M), -granulociti/monociti (CFU-GM) e –eosinofili(CFU-Eo) e per le cellule della linea HL-60, il terreno H4535 conteneva 50ng/ml stem cellfactor (SCF), 20 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml G-CSF, 20 ng/ml interleuchina-3 (IL-3) e 20 ng/mlIL-6. Per il saggio CFU dei progenitori eirtroidi (BFU-E) e le cellule della linea K562, ilterreno (H4434) conteneva 50 ng/ml SCF, 20 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml G-CSF, 20 ng/mlinterleuchina-3 (IL-3) e 3U/ml eritropoietina (Epo). Nonostante i progenitori CFU-G, CFU-M, CFU-G; e CFU-Eo sviluppino coonie anche nel trerreno H4434, abbiamo deciso ditestare questi progenitori in terreno H4535 perché è più completo per iprecursorigranulociti-monociti. Al momento della piastratura, le nanoparticelle sono state aggiuntealle concentrazioni indicate. Per minimizzare l’errore, ogni concentrazione è stata testat induplicato o triplicato, e un controllo negativo in duplicato o triplicato per ogni donatoreera sempre presente. Le piastre sono state incubate per 14 giorni a 37oC in 90% umidità e5% CO2. La conta delle colonie è stata effettuata con un microscopio ad unamagnificazione di 40X, seguendo procedure standard (38). L’effetto tossico dellenanoparticelle è stato determinato in funzione del numero di colonie cresciute in terrenocontenente le nanoparticelle, confrontato con il numero di colonie in terreno controllo.Per analisi successive, le colonie sono state estratte dalla coltura di metilcellulosa,risospese in IMDM e lavate in PBS. 44
  • 50. Materiali e Metodi3.5 COLTURA LIQUIDA DELLE CELLULE PROGENITRICI CD34+ MIDOLLARIL’espansione dei progenitori CD34+ provenienti dal midollo osseo è stata realizzataseguendo il primo passaggio di un protocollo a tre passaggi pubblicato da Giarratana et al.(18), con piccole modifiche. In breve, le fasi di proliferazione cellulare e le prime fasi deldifferenziamento sono stati indotti in un terreno senza siero (Iscove Modified DulbeccoMedium, IMDM) con l’aggiuntadi 4mM glutammina, 50 U/ml penicillina, 50 microg/mlstrptomicina, 1% BSA, 120 microg/ml trasferrina umana, 900 ng/ml solfato di ferro, 90ng/nitrato di ferro, 10 microg/ml insulina umana ricombinante, 10-6 M idrocortisone, 100ng/ml stem cell factor (SCF), 5 ng/ml interleuchina-3 (IL-3) e 1U/ml Epo. La concentrazionedi cellule era compresa tra 2x104 a 1.4x106 ml-1. Per indurre il differenziamento, abbiamoseguito un diverso protocollo precedente pubblicato da Migliaccio et al (30). In breve, lecellule sono state estratte dal terreno di crescita, lavate con IMDM e messe in coltura aduna concetrazione tra 1.8x105 a 5x105 cells/ml in IMDM in presenza di 20% FCS, 1U/mlEpo 2 10ng/ml insulina ricombinante umana. Le cellule vive sono state contate con unemocitometro, in presenza di trypan blue per l’esclusione di cellule morte.3.6 CITOMETRIA A FLUSSOIl profile antigenic dele cellule è stato analizzato con citometria a flusso, con un EPICS XLflow cytometer (Beckam Coulter), seguendo procedure standard. Le cellule sono statelavate in soluzione salina tamponata (PBS), incubate per 1 ora con PBS con l’aggiunta diFCS 1% ed anticorpo anti-CD71 di topo marcato con fluorescina sotiocianato (FITC)(Beckam Coulter). Una seconda aliquota di cellule è stata incubata con il corrispondentecontrollo isotipo, per escludere la fluorescneza non specifica. Il pattern di espression diCD71 nel presente lavoro è risultato simile ai dati pubblicati da Migliaccio et al (30). IlCD71 non è espresso nelle cellule progenitrici CD34+, altamente espresso nei progenitorieritroidi proliferanti e il livello di espressione scende nelle cellule differnziate. 45
  • 51. Materiali e Metodi3.7 PCR QUANTITATIVAL’RNA totale ès tato estratto dai campioni cellular mediante l’utilizzo di un kit commercial(RNeasy Mini Kit della Qiagen), seguendo le indicazioni del produttore del kit. Laquantificazione del contenuto totale di RNA è stata determinata con NanoDropSpectrophotometer (Thermo Scientific). Una quantità di RNA totale pari a 0.5-1.5 migrog èstata retrotrascritta con M-MLV Reverse Transcriptase (Promega), utilizzando oligodTcome primers e seguendo le istruzioni del produttore dell’enzima. La PCR quantitativa èstata eseguita utilizzando il Taqman Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems),seguendo le istruzioni del produttore. Le sonde e primers sono stati comprati da AppliedBiosystem, nel Gene Expression Assay specifico per ogni gene. La PCR quantitativa è stataeseguita con il sistema 7300 eal-Time PCR System (Applied Biosystems).3.8 MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE-TRASMISSIONE (STEM)I pellet cellulari sono stati fissati in 0.1 M tampone fostato e 2% glutaraldeide, post-fissatiin 0.1 M tampone fosfato con 1% OsO4, disidratati con acetone ed inclusi in resina eponcon il kit commerciale Epoxy Embedding Medium Kit (Sigma), seguendo istruzioni delproduttore. Sezioni ultrafini sono state tagliate con lam di diamante e posate su griglie dirame (TAAB Laboratoires Equipment Ltd.) ed analizzate con un miscroscopio oletronicoFiled Emission Gun-Environmental Scanning Electorn Microscope (Quante 200, FEICompany, The Netherlands) in modalità STEM, equipaggiato con un sistema di energydispersive spectroscopy (EDS) con EDAX (Ametek), per l’analisi chimica dellenanoparticelle incluse nei cmapioni cellulari.3.9 COLTURA DELLE LINEE CELLULARI UMANELe linee cellulari CEM, CEM-R (CEM VBL100, drug-resistant), Jurkat, Molt-4, HL-60, K562 eThp-1 sono state messe in coltura a 0.3 x 106 cellule/ml in terreno RPMI 1640 conl’aggiunta di 10% FCS, 4mM glutammina, 50 U/ml penicillina e 50 microg/mlstreptomicina. La coltura della linea variante multidrug resistant delle CEM (CEM-R) è 46
  • 52. Materiali e Metodistata supplementata con 100ng/ml vinblastina ogni settimana, per mantenere la selezione(29). Il terreno di differenziamento è stato preparato aggiungendo 1% dimetilsolfossido(DMSO), 50 microg/ml emina o 100 mircoM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) alterreno di crescita. Le cellule vive sono state contate con un emocitometro, in presenza ditrypan blue per l’esclusione di cellule morte. Siccome le cellule della linea Thp-1 durante ildifferenziamento in presenza di PMA si attacano al fondo della piastra di coltura, percontarle sono state lavate in PBS e trattate con tripsina. Le fotografie delle colture cellularisono state scattate ad un microscopio dotato di CCD camera (Olympus).3.10 GENE EXPRESSION ARRAYLe cellule CD34+ del midollo osseo umano sono state coltivate per 8 giorni in terrenoproliferativo, come descritto nel paragrafo 3.5. Al giorno 8 di coltura, i campioni cellularisono stati divisi in 2 campioni uguali. Ad uno abbiamo aggiunto le NP di Sb2O3 a 5microg/ml, mentre l’altro campione è stato usato come controllo non trattato. Dopoulteriori 6 ore di coltura, le cellule sono state raccolte e lavate. L’RNA è stato estrattoutilizzando il kit della Qiagen Rnaseasy, seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzandopoi il kit commerciale della SABiosciences (RT2 profiler PCR assay system, Pathfinder),l’RNA è stato trascritto in cDNA, e l’espressione di 84 geni è stata analizzata con PCRquantitativa, seguendo scrupolosamente le indicazioni del produttore del kit.3.11 PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE SIERICHE LEGATE ALLE NANOPARTICELLE0,5 ml di siero umano per campione è stato de-complementato a 56oC per 20 minuti efiltrato con filtro da 0,22 micrometri. 0,5 ml di PBS sono stati aggiunti, in cui era discioltoun cocktail di inibitori delle proteasi. Una stessa quantità di PBS inibitore dell proteasi èstato aggiunto e disciolto. Le nanoparticelle sono state aggiunte a 12,5 microgrammi/ml,mentre nessuna nanoparticella è stata aggiunta nel controllo. I campioni sono statiincubati a temperatura ambiente per 4 ore in costante agitazione (rotamixer), dopodichèsono stati fatti centrifugare a 5,000x5 per 10 minutia 20 oC. Il pellet è stato lavato 3 volte, 47
  • 53. Materiali e Metodicentrifugando a 3,000xg per 5 minuti a 20oC in PBS, RIPA buffer oppure unImmunoPrecipitation Wash Buffer, composto da 100mM Tris pH7.4, 1% NP40, 250 mMsaccarosio, protease inhibitors (Roche). Il pellet è stato infine rispospeso in 25 microlitri diLaemli buffer, bollito per 5 minuti, e “caricato” su un gel di elettroforesi al 8% oppure 12%di acrilammide. La colorazione del gel, avvenuta alla fina della corsa elettroforetica del gel,è stata eseguita seguendo protocolli standard con Comassie Blue.3.12 ANALISI STATISTICAOgni esperiemtno è stato eseguito almeno in duplicato, come indicato nelle legende dellefigure. I risutlati sono espressi come media +/- Standard Deviation di esperimenti separati(in numero n, indicato in ogni legenda). I dati in figura 1 sono stati analizzatistatisticamente applicando il t-test, mediante l’utilizzo del programma SigmaStat 3.5(Systat Software, Inc.). p<0.05 è stato considerato come indice di differenza significativatra due gruppi di dati. 48
  • 54. 4. RISULTATI 49
  • 55. Risultati4.1 EFFETTO DI 7 NANOPARTICELLE METALLICHE SULL’ABILITA’ DI CELLULEPROGENITRICI EMATOPOIETICHE DI FORMARE COLONIE (CFU assay)Abbiamo testato l’effetto delle 7 nanoparticelle metalliche (Au, TiO2, Fe3O4, Fe2O3, Ag, Coe Sb2O3) sulla crescita e differenziamento delle cellule progenitrici ematopoietiche (HPCs)CD34+ del midolo osseo umano, mediante il saggio della formazione di colonie detto “CFUassay”. 500 cellule/ml sono state piastrate in pozzetti di piastre da 6, in terreno semisolidocontentente metilcellulosa e tutti i fattori di crescita necessari per lo sviluppo di coloniebianche (dai progenitori CD34+ granulocitici-monocitici CFU-G/CFU-M/CFU-GM/CFU-Eo) orosse (dai progenitori CD34+ eritroidi BFU-E). Durante la piastratura, le nanoparticelle (NP)sono state aggiunte alla concentrazione nominale di 5, 25 e 100 microg/ml (ppm). LaFigura 4.1 mostra il numero di colonie al giorno 14, espresso come relativo alle piastrecontrollo (senza l’aggiunta delle NP). Le NP di Au, TiO2, Fe2O3, Fe3O4 e Ag non hanno avutoeffetti sulla formazione delle colonie bianche (Fig 4.1a, sinistra) ne’ sulle colonie rosse (Fig4.1a, destra).Le NP di Co hanno avuto un effetto tossico su entrambi i tipi di colonie (bianche e rosse):alle concentrazioni maggiori (25 e 100 ppm) la formazione delle colonie era del tuttoinibita, mentre a 5 ppm le colonie sono cresciute solo del 25% rispetto al controllo (Fig4.1b e c). L’osservazione della tossicità delle NP di Co, che abbiamo vistoa che sulle linnecontinue K562 e CEM (non mostrato), è compatibile con uno studio condotto su celluleendoteliali umane, ed è probabilmente dovuta agli ioni di Co che vengono rilasciati dalleNP (45).Anche le NP di Sb2O3 hanno esercitato un effetto tossico alle concentrazioni maggiori (25 e100 ppm), sia sui progenitori delle colonie bianche che su quelli delle colonie rosse.Invece, alla concentrazione più bassa abbiamo osservato un interessante effetto specifico:a 5 ppm le NP di Sb2O3 non avevano nessun effetto sulle colonie bianche, mentreinibivano completamente la formazione delle colonie rosse (Fig 4.1b e c).La curva dose-risposta (Fig 4.2) ha mostrato che già a 2.5 ppm le NP di Sb2O3 hanno uneffetto tossico sui progenitori eritroidi, permettendo solo la crescita del 75% delle colonie. 50
  • 56. RisultatiE’ da notare, comunque, che le colonie eritroidi cresciute in presenza di NP di Sb2O3 allaconcentrazione di 2.5 ppm sono morfologicamente alterate, ovvero più piccole e scure.Figura 4.1 Saggio di sviluppo delle colonie (CFU assay) dei progenitori granulocitici-monocitici (white colonies: CFU-G/CFU-M/CFU-GM/CFU-Eo) ed eritroidi (red colonies:BFU-E) in presenza delle NP. Asse Y: numero di colonie al giorno 14 di coltura, espressocome percentuale rispetto al controllo non trattato. (a) Le NP indicate sotto all’asse X sonostate aggiunte alle concentrazioni in parentesi (ppm), n=2 ognuno in duplicato. (b,c) NP diCo o Sb2O3 sono state aggiunte alle concentrazion indicate. L’asterisco (*) indica differenzasignificativa (p<0.05). n=4 per Co e n=5 per Sb2O3, ognuno in duplicato o triplicato. Labarra degli errori rappresenta la deviazione standard. Per NP di Sb2O3 alla concentrazionedi 5 ppm, n=9. Ciascun n deriva da donatori diversi. 51
  • 57. Risultati d Number of colonies (% over control) 100 50 White Co White colonieslonies Red Colonies Red colonies 0 Sb2O3 NPs (ppm) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Sb2O3 (ppm) Sb2O3 NPs (ppm)Figura 4.2 Curva dose-risposta, CFU assay dei progenitori eirtroidi midollari (red colonies,quadratini neri) o progenitori granulocitici-monocitici midollari (white colonies, triangolinineri), in presenza di diverse concentrazioni di NP di Sb2O3.In conclusione di questi due primi esperimenti, possiamo dedurre che le NP di Au, TiO2,Fe2O3, Fe3O4 e Ag non hanno mostrato di esercitare alcun effetto tossico, in relazione allacapacità di progenitori eirtroidi e granulocitici-monocitici di formare colonie. Le NP di Co,invece, sono risultate tossiche a tutte le concentrazioni, infatti a 100 e 25 ppm laformazine delle colonie era totalmente inibita, mentre a 5 ppm il numero di colonie erasolo il 25% rispetto al controllo. Le NP di Sb2O3, infine, hanno mostrato l’ effetto piùinteressante: nonostante a 100 e 25 ppm queste NP inibissero totalmente la formazione dicolonie bianche e rosse, a 5 ppm le NP di Sb2O3 esercitano un effetto otssico soltanto sullecellule progenitrici eritroidi, essendo innocue invece ai progenitori granulocitici-monocitici. 52
  • 58. Risultati4.2 EFFETTO DELLE NANOPARTICELLE DI Sb2O3 SULL’ERITROPOIESIIn seguito alle osservazioni precedentemente illustrate, abbiamo ritenuto interessanteapprofondire il meccanismo di tossicità delle NP di Sb2O3 sulle cellule eritroidi. In primoluogo, ci siamo chiesti se questo effetto tossico avesse luogo durante la fase diproliferazione o durante la fase di differenziamento dello sviluppo eritroide. Ci siamo cioèchiesti se l’effetto tossico fosse sulla cellula progenitrice CD34+ che inizialmente prolifera,oppure se la tossicità si manifestasse pià avanti, quando la cellula smette di proliferare edinizia a differenziare. Nella coltura semisolida del CFU assay, l’evento di proliferazione equello di differenziamento non sono distinguibili, in quanto non è possibile sincronizzare lecellule. Dopo 7 giorni dalla piastratura delle cellule si inziano a vedere le prime colonieancora piccole, in cui alcune cellule stanno ancora proliferando ed altre stannodifferenziando. Abbiamo quindi cercato di creare un sistema in vitro che ci permettesse didistinguere le due fasi di proliferazione e differenziamento, in modo da poter aggiungerele NP di Sb2O3 in ciascuna delle due fasi ed osservare l’effetto. Dopo aver provato diversiprotocolli per l’espansione eritroide delle cellule progenitrici CD34+ provenienti dalmidollo osseo umano, abbiamo scelto di combinare due protocolli diversi, entrambipubblicati.Per la fase di proliferazione (expansion phase), abbiamo seguito la prima parte di unaprotocollo diviso in 3 fasi, messo a punto dal laboratorio del professor Douay (18). Perl’analisi della fase differenziativa, abbiamo seguito il protocollo messo a punto nellaboratorio del prof. Migliaccio (30).Come controllo della rilevanza di questo modello, abbiamo eseguito un’analisi fenotipica,sia a livello di marcatori proteici che a livello di espressione genica, delle cellule coltivatenella fase di proliferazione e in quella di differenziamento. Normalmente, l’espressionedella proteina di superficie CD71 aumenta durante la proliferazione e le prime fasi didifferenziametno dei prognitori eritroidi, per diminuire nelle ultime fasi differentziative edi maturazione, come si vede in (30). Inoltre, la morfologia delle cellule eritroidi cambiadurante lo sviluppo eritroide. Le cellule progenitrici grandi gradualmente diminuiscono, 53
  • 59. Risultatifino a raggiungere una dimensione di circa 7 micrometri quando hanno espulso il nucleo.Come si vede in Figura 4.3, l’espressione della proteina di superficie CD71 è omogenea edelevata nella popolazione di cellule proliferanti (Fig 4.3A). Invece, dopo 3 giorni di crescitanel terreno differenziativo, l’espressione di CD71 diminuisce, con la divisione di duepopolazioni: una popolazione di cellule più grandi (valori di Forward Satter nell’asse X piùelevati), ed espressione elevata di CD71. La seconda popolazione è di cellule piùdifferenziate/mature: più piccole (valori di Forward Scatter nell’asse X più bassi) in cuil’espressione di CD71 sta scomparendo.A livello di espressione genica, abbiamo analizzato i livelli di mRNA del recettoredell’eritropoietina (EPOR) e della beta globina, entrambi marcatori di differenziamentoeritroide. Come si vede in Figura 4.3 B e C, questi due geni sono poco espressi durantetutto il tempo di coltura in terreno proliferativo, ed aumentano bruscamente quandotogliamo il terreno proliferativo per sostituirlo con terreno differenziativo.L’analisi fenitopica delle cellule, trattate con i due metodi, ha mostrato che lacombinazione dei due protocolli è risultata in un nuovo metodo valido per l’analisi dellaproliferazione, separatamente dall’analisi del differenziamento, dei procursori eirtroidi. 54
  • 60. RisultatiFigura 4.3 Analisi fenotipica delle cellule in fase proliferativa e fase differenziativa. (A)l’espressione di CD71 sulla superficie delle cellule è stata analizzata con citometri a flusso. 55
  • 61. RisultatiSeguendo questo metodo, il numero di cellule aumentava gradualmente in coltura, fino araggiungere una espansione di quasi 100 volte in 8 giorni, e oltre200 volte dopo 10 giorni,rispetto al numero di cellule messe in coltura al giorno 0 (Fig 4.4, ). Se le NP di Sb2O3venivano aggiunte al giorno 0, oppure in qualsiasi momento durante la fase espansivadella coltura, la crescita cellulare si fermava immediatamente, come mostrato in Figura 3,in cui le NP vengono aggiunte alla coltura al giorno 0 (Fig 4.4, sinistra, ) oppure al giorno9 (Fig 4.4, destra, ).Questo esperimento ci ha suggerito che le NP fossero tossiche ai progenitori eirtroidi nellafase di proliferazione. Control Expansion Phase Sb2O3 NPFigura 4.4 Coltura liquida dei progenitori eritroidi da cellule CD34+ del midollo osseoumano. In condizioni controllo ( , senza NP aggiunte), la proliferazione aumentagradualmente fino al giorno 10, in cui si ha una espansione cellulare di oltre 200 volterispetto al numero di cellule messe in coltura il giorno 0; inseguito all’aggiutna di NP diSb2O3 ( ), la proliferazione è inbita e le cellule muoiono. Esperimento rappresentativo di 3esperimenti separati, ciascuno eseguito in duplicato. 56
  • 62. RisultatiCi siamo chiesti se l’effetto tossico fosse esercitato anche durante la fase deldifferenziamento. Per rispondere a questa domanda, abbiamo espanso le celluleprovenienti dal midollo osseo nelle condizioni proliferative per 8 giorni, dopodichèabbiamo lavato le cellule, e le abbiamo messe in coltua in presenza di un terrenoottimizzato per il differenziamento delle cellule eritroidi (differentiative phase), per unperiodo massimo di 4 gironi. In questo sistema, quando abbiamo aggiunto le NP di Sb2O3durante la fase differenziativa, abbiamo osservato una crescita minimamente rallentatadel numero di cellule, ma nessuna morte cellulare (on il metodo del Trypan blue) (fig. 4.5a). I controlli mediante citometri a flusso ed PCR quantitativa hanno mostrato che lecellule trattate con NP di Sb2O3 durante la fase di differenziamento erano fenotipicamentesimili alle cellule controllo non trattate (fig. 4.5 b-d), suggerendo che le NP di Sb2O3 nonesercitino l’effetto tossico durante il differenziamento dei progenitori eritroidi. a b cFigura 4.5 Effetto del trattamento delle cellule midollari CD34+ con NP di Sb2O3 durante lafase differenziativa, dopo 8 giorni di coltura in terreno per la proliferazione e successivacoltura in terreno differenziativo per 3 giorni. Le NP sono state aggiunte al giorno 0 dellafase differenziativa. (a)proliferazione in assenza o presenza delle NO (5ppm). Asse Y:aumento del numero di cellule. Esperimento rappresentativo di 3 esperimenti separati. (d)Citometria a flusso in assenza (riquadro superiore) o presenza delle NP di Sb2O3 . 57
  • 63. Risultati4.3 ANALISI DELL’INTERAZIONE TRA Sb2O3 E CELLULE PROGENITRICI ERITROIDIUn elemento fondamentale per comprendere il meccanismo di tossicità dellenanoparticelle è l’analisi del contatto fisico tra le NP e le cellule, e l’eventualelocalizzazione intracellulare delle particelle. Nel sistema che abbiamo sviluppato in questostudio, abbiamo visto che le NP di Sb2O3 esercitano un effetto tossico sulle celluleprogenitrici eritroidi (“rosse”), mentre non mostrano un effetto tossico sui progenitorimaonociti-granulociti (“bianchi”). Abbiamo quindi ritenuto interessante vedere qualeinterazione ci sia tra queste nanoparticelle ed i due tipi di progenitori, per determinare sela differenza di effetto posso essere dovuta ad una interazione fisica diversa con iprogenitori “rossi” rispetto ai progenitori “bianchi”.Abbiamo eseguito analisi con un microscopio elettronico a scansione e trasmissione(STEM) su campioni di cellule eritroidi cresciute in terreno proliferativo per 8 giorni, etrattate con NP di Sb2O3 per 0, 6 o 24 ore (fig. 4.6).In figura 6, si può notare la cellula controllo (fig. 4.6a), che ha le caratteristiche di unprogenitore eritroide normale con elevata proporzione nucleo/citoplasma e cromatinadispersa con presenza di nucleoli. Dopo 6 ore di trattamento con NP di Sb2O3 (fig. 4.6b,c),circa il 50% delle cellule avevao una morfologia molto alterata, con nuclei piccoli,cromatina più condensata e marginata e grandi vacuoli apparentemente vuoti, chepotevano raggiungere e suprerare un diametro di 2 micrometri. La supreficie di questecellule era molto più irregolare rispetto alle cellule controllo, con u citoplasma menoelettrondenso. In queste cellule che avevano una morfologia alterata, le NP eranolocalizzate vicino alla superficie cellulare. In molti casi, le NP apparivano incluse nellaporzione marginale della membrana plasmatica (fig. 4.6c e inserto).Dopo 24 ore di trattamento (fig. 4.6d), le cellule apparivano principalmente distrutte, conformazioni che assomilgiavano a corpi apoptotici e cellule apoptotiche. Questo era in lineacon le osservazioni al microscopio ottico, attraverso il quale le cellule trattate per 24 oreapparivano morfologicamente alterate, scure e di dimensioni inferiori. L’identità chimicadelle NP è stata determinata con EDS. 58
  • 64. RisultatiFigura 4.6 Analisi al microscopio elettronico (STEM). Cellule CD34+ del midollo osseoumano sono state cresciute per 8 giorni in terreno proliferativo. Le NP di Sb2O3 (5ppm)sono state aggiunte 6 ore (b,c) o 24 ore (d) prima della preparazione dei campioni. (a)cellula non trattata con NP. a bFigura 4.7 STEM analisi di precursori granulocitici-monocitici in assenza (a) o presenza per14 giorni (b) di NP di Sb2O3 . 59
  • 65. RisultatiL’inclusione intracellulare di NP di Sb2O3 in progenitori eritroidi non è stata osservata neicampioni analizzati. Una piccola percentuale (circa 1-2%) delle cellule avevano inclusioniintracellulari di NPs, ma l’identità di queste cellule più rare non è risultata chiara. Infatti,queste cellule avevano una morfologia che non appariva corrispondente a celluleapoptotiche, né a precursori eitroidi, né a precursori granulocitici-monocitici. Unasomiglianza a precursori megacariocitici è stata notata, ma nessun esperimento dimarcatura con specifici marcatori è stato eseguito per determinare l’identità di questerare cellule.Per l’osservazione allo STEM di cellule della linea granulocitica-monocitica, abbiamoestratto colonie bianche da colture semisolide in metilcellulosa (CFU assay descritto insezione 4.1), che erano state incubate per 14 giorni in presenza o assenza di NP di Sb2O3alla concentrazione di 5 ppm.I campioni sono stati preparati ed analizzati nello stesso modo in cui sono stati trattati icampioni eritroicitici. L’osservazione ha mostrato che, almeno nei campioni da noiosservati, non c’era un contatto fisico tra le nanoparticelle e le cellule granulocitiche-monocitiche (fig. 4.7).L’analisi allo STEM ha mostrato che l’interazione delle NP di Sb2O3 con i progenitorieritroidi avviene a livello della memebrana plasmatica. Questa interazione non avvienecon i progenitori granulocitici-monocitici. 60
  • 66. Risultati4.4 ANALISI DEL SIGNALINGDai dati mostrati fin qui, si evince che le NP di Sb2O3 interagiscono con la membranacellulare dei progenitori eritroidi durante il processo di proliferazione e lo inibisconoinducendo morte cellulare. Questo effetto tossico non si manifesta se le NP vengonomesse a contatto con le cellule progenitrici durante la fase del differenziamento, eneppure se le cellule progenitrici sono entrate nella via differenziativa dei monociti-macrofagi anziché nella via eritroide. Queste osservazioni fanno pensare ad unmeccanismo specifico di tossicità, ovvero che danneggia la cellula soltanto durante alcunimomenti della sua vita (proliferazione), ma che è già destinata ad una particolare funzione(globulo rosso, anziché granulocito-monocito).Questo primo passo, verso la identificazione dei meccanismi di tossicità delle NP di Sb2O3,ci ha spinto ad indagare quali siano i primi segnali di tossicità che la cellula manifesta,attraverso l’analisi dell’espressione genica ed il paragone tra cellule non trattate e celluletrattate con NP di Sb2O3 a 5 ppm. Per questo, abbiamo coltivato in terreno diproliferazione le cellule progenitrici CD34+ del midollo umano per 8 giorni, al fine di avereun numero sufficiente di cellule per l’esperimento di gene expression analysis. Al giorno 8,abbiamo diviso la coltura in 2 campioni uguali, trattato uno dei due con le nanoparticelleper 6 ore, e poi raccolto i campioni ed estratto l’RNA. Abbiamo scelto questo time pointpoichè dagli studi di mictroscopia elettronica esposti sopra, avevamo visto che già dopo 6ore le cellule avevano accumulato alterazioni morfologiche notevoli; dopo 24 ore ditrattamento, invece, le cellule apparivano morte, quindi non ci era sembrato opportunoraccogliere materiale genetico da quest’ultimo tipo di campione. Mediane l’utilizzo di unkit commericale, abbiamo estratto l’RNA totale, retrotrascritto l’mRNA in cDNA, e poiabbiamo analizzato l’espressione di 84 geni, oltre ai geni di controllo, che sono implicati indiverse vie di trasuzione del segnale.L’elenco dei geni analizzati e dell’up-regulation o down-regulation di questi geni, incampioni trattati rispetto a campioni controllo, è illustrato in Tabella 4.1. 61

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