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Por que validar métodos analíticos

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Published on: Mar 4, 2016
Source: www.slideshare.net


Transcripts - Por que validar métodos analíticos

  • 1. ¿POR QUE VALIDAR MÉTODOS ANALÍTICOS?Hoy en día los laboratorios deben demostrar que sus métodos analíticos proporcionanresultados fiables y adecuados para su finalidad y propósito perseguido ya que muchasde las decisiones que se toman están basadas en la información que estos datosproporcionan. La validación de las metodologías, junto a otras actividades englobadasen el control del aseguramiento de la calidad, permite demostrar a los laboratorios quesus métodos analíticos proporcionan resultados fiables.Validar un método consiste enverificar y documentar su validez, esto es, su adecuación a unos determinadosrequisitos, previamente establecidos por el usuario para poder resolver un problemaanalítico particular. Estos requisitos son los que definen los parámetros o criterios decalidad que debe poseer un método a utilizar para resolver el problema analítico. Lafigura 1 muestra que estos criterios de calidad pueden ser de tipo estadístico o bien detipo operativo /económico.Tipo estadístico Tipo operativo/económicoExactitud, Rastreabilidad InversiónPrecisión, Incertidumbre MantenimientoReproducibilida RapidezEspecificidad Facilidad de usoSelectividad SimplicidadLímite de detecciónLímite de cuantificaciónRobustezFigura 1.1. Parámetros de calidad de un método analítico. Según la norma ISO/IEC7025,’ los laboratorios deben validar todos los métodos que se utilicen en el laboratorio,tanto los desarrollados por ellos mismos como aquellos procedentes de fuentesbibliográficas o desarrollados por otros laboratorios. Además, también es necesario queel laboratorio valide los métodos de referencia aunque, en este caso, no es necesario queel laboratorio realice una validación completa. Asimismo, el laboratorio debe validartodo el procedimiento* analítico teniendo en cuenta el intervalo de concentraciones y dematrices de las muestras de rutina. Los criterios de calidad que al menos debenverificarse son la exactitud, la precisión y la incertidumbre de los resultados obtenidoscon el método ya que, de esta forma, se obtienen resultados rastreables y comparables.El procedimiento analítico es el resultado de la adaptación de un método analítico,disponible en la bibliografía para determinar un analito, al análisis de muestrascaracterizadas por la naturaleza de la matriz.Para la industria farmacéutica una de las características más importantes de todaempresa es la calidad de sus productos, ya que de ésta dependerán tanto el prestigiocomo el desarrollo económico y el crecimiento de la misma. Atendiendo a estanecesidad se han venido formulando diferentes programas y parámetros por variasinstituciones para lograr el aseguramiento de la calidad de los distintos productos.Entre las agencias reguladoras más importantes se tiene a nivel internacional la Foodand Drug Administration (FDA) y la International Conference on Harmonization (ICH),a través de las Good Manufacturing Practices (GMP´s) y Good Laboratory Practices(GLP´s).Así pues, una de las herramientas con las que se cuenta para asegurar la calidadde los productos y procedimientos es la validación de los mismos, por lo cual, laadopción de un nuevo método analítico debe estar soportado por suficientes datos delaboratorio y una validación bien documentada, que cumpla con los requisitosestablecidos en México por la Secretaria de Salud y las instituciones internacionalescomo la FDA, el ICH.
  • 2. Por este motivo es necesario el uso de la estadística, puesto que la necesidad de soportarel proceso de validación exige el tratamiento estadístico para el manejo y análisis de losdatos permitiendo juicios con criterio que llevan a una correcta evaluación. El uso deestadística (descriptiva e inferencial) asociada a un estudio de variabilidad de métodosanalíticos, fue reportado en la literatura desde 1946. Posteriormente Youden publicó en1975 un Manual.Estadístico en la Asociación de Químico Analistas Oficiales (A.O.A.C.) en el cual sereportaron las bases de la validación de métodos. En 1978 la Asociación Química de laSociedad Americana para el Control de Calidad una descripción de diseños yprocedimientos evaluativos, así como detalles para las pruebas de tolerancia de métodosanalíticos.Para hablar de validación, es necesario conocer su significado.La validación de un método analítico es el proceso mediante el cual se establece pormedio de estudios de laboratorio que las características representativas del métodoanalítico cumplen con las especificaciones para su aplicación.La validación debe ser tan exhaustiva como sea necesario para responder a lasnecesidades de la aplicación en cuestión. La validación puede incluir procedimientospara el muestreo, manejo y transporte de muestras. El laboratorio deberá validar:métodos no estandarizados métodos diseñados o desarrollados internamente métodosestandarizados usados fuera del alcance propuesto ampliaciones o modificaciones demétodos estandarizados (cuando se realizan algunos cambios en los métodos noestandarizados ya validados, se debe documentar la influencia de tales cambios y, si esnecesario, se debe efectuar una nueva validación)La validación incluye: la especificación de los requisitos la determinación de lascaracterísticas de los métodos una verificación de que se pueden cumplir los requisitosal usar el método una declaración de su validezLa técnica para determinar el funcionamiento de un método puede ser una de lassiguientes o su combinación: calibración con el uso de normas o materiales dereferencia comparación de resultados obtenidos por otro(s) método(s) comparacionesentre laboratorios evaluación sistemática de los factores que influyen en los resultadosevaluación de la incertidumbre de los resultados basados en el conocimiento científicode los principios teóricos del método y la experiencia práctica.El laboratorio deberá registrar: los resultados obtenidos el procedimiento usado para lavalidación, y una declaración acerca de que el método se ajusta al uso propuestoPara las necesidades de los clientes deben ser relevantes el intervalo y la exactitud delos valores que se pueden obtener de los métodos validados, como son:La incertidumbre de los resultadosLímite de detecciónSelectividad del métodolinealidadlímite de repetibilidad y reproducibilidadrobustez contra influencias externassensibilidad cruzada contra interferencias de la matriz de la muestraConforme avance el desarrollo del método, se deben llevar a cabo revisiones regularespara verificar que se siguen cumpliendo las necesidades del cliente. Cualquier cambio
  • 3. en los requisitos que necesiten modificaciones en el plan de desarrollo debe seraprobado y autorizado.Validación de métodos normalizadosSi bien la norma ISO/IEC 17025 no requiere la validación de los métodos normalizadosaplicados en un laboratorio específico, sí establece que se deberán obtener datos sobre elrendimiento de su propio uso, es decir que siempre resulta apropiado contar con algúngrado de validación, incluso cuando se utilicen métodos normalizados.Con frecuencia seasume que los métodos normalizados se pueden aplicar directamente y que sealcanzarán los niveles de rendimiento publicados por quienquiera que utilice el método,pero este no es un supuesto seguro. Se debe al menos practicar con el método a travésde un proceso de capacitación para alcanzar una competencia aceptable.Para métodosnormalizados debe verificarse si la información existente sobre su validación esadecuada para el propósito requerido y si el laboratorio es capaz de alcanzar el nivel derendimiento que se reporta como posible. Ante los cambios de analista es mas relevantecontrolar el rendimiento del analista respecto a lo que se requiere y no según lainformación publicada en el método, aunque siempre es posible al menos verificar dichainformación.De acuerdo con lo anterior, un método debe validarse cuando seanecesario verificar que los parámetros de rendimiento son adecuados para usarlos enunproblema analítico específico se incorporen mejoras en el método se amplíe el alcancedel método para nuevas matrices el control de calidad indique que el método estácambiando con el tiempo el método se use en un laboratorio diferente o con diferentesanalistas o instrumentosParámetros de validación de un métodoA continuación se hace una breve descripción de los parámetros que permiten evaluar elrendimiento de un método y se hace una indicación de qué se puede analizar paraevaluar cada parámetro. Confirmación de identificación, selectividad y especificidadLa identidad se establece cuando la señal producida en la etapa de medición puede seratribuida únicamente al analito y no a la presencia de algo similar o la coincidencia. Laselectividad y la especificidad evalúan la confiabilidad de las mediciones ante lapresencia de interferencias; la segunda se considera por lo general como un 100% deselectividad. Las interferencias pueden disminuir o aumentar la señal atribuida alanalito.Estos parámetros no requieren mayor validación cuando se utilizan procedimientosnormalizados para una matriz específica, puesto que el trabajo ya lo han adelantadoquienes desarrollaron y validaron el método. En estos casos se deben tener muy encuenta las especificaciones sobre posibles interferencias y la manera de suprimirlas, siexisten. Sin embargo, el laboratorio debe considerar el estudio de las interferencias en lavalidación si las matrices de las muestras que analiza son muy variadas y si en alguna deellas los interferentes se encuentran en niveles muy altos que pueden no ser suprimidospor los procesos recomendados. Este sería un caso de ampliación del alcance delmétodo para nuevas matrices.La selectividad de un método se estudia adicionando demanera deliberada a una muestra las interferencias que se crea tengan mayorprobabilidad de estar presentes en las muestras. Si no se conoce a ciencia cierta laexistencia o no de interferencias, se puede valorar la selectividad del método porcomparación con la aplicación de otro método. La selectividad también puede estarafectada por la existencia del analito en una muestra en más de una forma, como libre oenlazado, o en diferentes estados de oxidación.Límite de detecciónSe debe saber cuál esla mínima concentración del analito que se puede detectar confiablemente cuando seaplica un método para el análisis de una muestra, aunque no existe un acuerdo universalsobre la terminología y existen varios criterios para su cuantificación. En algunos casos
  • 4. es suficiente brindar una indicación del nivel en el que la detección se torna menosconfiable (promedio de lectura de blancos del método más tres veces su desviaciónestándar), pero resulta conveniente aplicar una metodología más exacta; en cualquiercaso se recomienda informar el mecanismo seleccionadoLímite de cuantificaciónEl LC es la mínima concentración de analito que se puede determinar con un nivelaceptable de precisión (repetibilidad) y exactitud. Varias convenciones lo definen comola concentración de analito correspondiente al valor del blanco más 5, 6 ó 10desviaciones estándar de la media de blancos. Ninguno de los dos límites representanniveles en los que la cuantificación es imposible; es simplemente una región en que lamagnitud de las incertidumbres asociadas es de valor semejante al resultado real. Ellímite de cuantificación no se debe determinar por extrapolación por debajo del menorestándar analizado. Intervalo de trabajo e intervalo linealSe debe determinar el intervalo de concentraciones de analito dentro del cual se puedeaplicar el método; esto se refiere a las concentraciones efectivamente medidas y no a lasmuestras originales. En el extremo inferior del intervalo de concentraciones el factorlimitante es el valor del límite de detección; en el extremo superior el alcance dependede la respuesta del instrumento o de condiciones analíticas establecidas como óptimas.Dentro del intervalo de trabajo puede existir un rango de respuesta lineal (intervalolineal); los cálculos de regresión por si solos pueden ser insuficientes para establecer lalinealidad; se debe complementar con una inspección visual de la línea y los residuos.En general los controles de linealidad requieren efectuarse con al menos 10concentraciones o valores diferentes.La evaluación del intervalo de trabajo y del intervalo lineal permiten definir qué gradode calibración se requerirá al usar el método; en el intervalo lineal puede ser suficienteun punto de calibración para establecer la pendiente de la línea de calibración. En elresto del intervalo de trabajo será necesaria la calibración en múltiples puntos,preferiblemente más de seis. La respuesta del instrumento a la concentración no tieneque ser perfectamente lineal para que el método sea eficaz, pero la curva debe serrepetible cotidianamente. El intervalo de trabajo y el intervalo lineal pueden serdiferentes para matrices diferentes según el efecto de las interferencias que aporte lamatriz.Exactitud (y sesgo)La exactitud, que es la cercanía de un resultado al valor verdadero, se evalúa en lavalidación por comparación con los valores de referencia de un material caracterizado(material de referencia, MR), o con valores tomados de otro método caracterizado. Losvalores de referencia deberían ser trazables a las normas internacionales; los materialesde referencia certificados (MRC) generalmente se aceptan como trazables. Es ideal queel MR sea de matriz natural lo más similar posible a las muestras de interés. En casocontrario los MR pueden ser: preparados por adiciones de MRC puro u otros de purezay estabilidad adecuadas a muestras típicas, o muestras típicas bien caracterizadas,controladas para verificar su estabilidad y pasadas por un proceso interno de control decalidad.Usualmente la aplicación de un método involucra un sesgo combinado: el sesgo delmétodo que surge de errores sistemáticos inherentes a él (sin importar el laboratorio queaplica el método), y el sesgo del laboratorio que surge de errores sistemáticoscaracterísticos del laboratorio. El sesgo obtenido en una validación debe compararse conel sesgo reportado para el método y el obtenido por varios laboratorios que utilicen elmismo método
  • 5. PrecisiónLas dos medidas más comunes de la precisión, que generalmente se define en términosde la desviación estándar o el coeficiente de variación (desviación estándar relativa) sonla repetibilidad y la reproducibilidad. La repetibilidad, que es la precisión más pequeñaesperada, da una idea de la variabilidad que se espera cuando un método es aplicado porun solo analista en un equipo durante un periodocorto (análisis por duplicado). En el otro extremo, la reproducibilidad, que representa lavariabilidad que se obtiene cuando una muestra es analizada por varios laboratoriostiene un valor más amplio. La precisión intermedia y más útil en casos específicos seobtiene cuando se evalúa la reproducibilidad entre analistas en un mismo laboratorio.Larepetibilidad y la reproducibilidad generalmente depende de la concentración del analitoy por lo tanto se deben determinar para diferentes concentraciones, estableciendo,cuando sea relevante, la relación entre la concentración y el coeficiente de variación. Apartir de las desviaciones estándar de repetibilidad (sr) y reproducibilidad (sR) sepueden calcular los límites de repetibilidad, r, y de reproducibilidad, R, que permiten alanalista saber si la diferencia entre análisis duplicados es significativa, en las respectivascondiciones.Incertidumbre de mediciónLa incertidumbre de medición es un parámetro simple que expresa el rango de valoresposibles sobre la base del resultado de la medición; su estimación por procedimientosadecuados toma en cuenta todos los efectos reconocidos que afectan el resultado. Laestimación de la incertidumbre de un método debe tomar en cuenta la precisión generalde largo plazo, el sesgo, la incertidumbre del MR, la incertidumbre de calibración, ycualquier otro efecto significativo, como pueden ser la temperatura o tiempo de análisis,si aplican.SensibilidadLa sensibilidad es el gradiente de la curva de respuesta, o lo que es lo mismo, el cambioen la señal correspondiente a un cambio de concentración de analito. Para el intervalolineal de un método, la sensibilidad corresponde a la pendiente de la recta decalibración, y es un parámetro objeto de seguimiento cuando se efectúan calibracionesrutinarias.RobustezEs una medida de qué tan bien responde un método analítico ante una implementaciónno tan perfecta, ya que si ciertas etapas del método no se implementan con el suficientecuidado, tendrán un efecto severo sobre la efectividad del método. Generalmente esteparámetro aplica para métodos desarrollados por el laboratorio, en los cuales se realizanvariaciones deliberadas en el método y se cuantifica el efecto en el rendimiento, antesde entrar en estudios de colaboración. Por lo tanto es una variable que nonecesariamente debe ser objeto de la validación cuando se utilizan métodosnormalizados.ToleranciaSe deben establecer aquellos factores ajenos al método como diferentes equipos, lotesde reactivos, columnas, etc., que se puedan presentar al reproducir el método en otrascondiciones de uso.Estabilidad analítica de la muestra
  • 6. Propiedad de una muestra, preparada para su cuantificación, de conservar su integridadfisoquímica y la concentración del analito, después de almacenarse durante un tiempoeterminado bajo condiciones específicas.Así pues, la evaluación o no de los parámetros arriba mencionados dependerá del tipode información que se requiera obtener de dicha validación, es decir del objetivoperseguido, con base a esto los procedimientos de ensayo se han clasificado en generalcomo lo marca la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) en las siguientes categorías:Categoría I . Métodos analíticos para la cuantificación de los principales componentesde fármacos o de principios activos en productos farmacéuticos terminados.Categoría II . Métodos analíticos para la determinación de impurezas en fármacos oproductos de degradación en el producto farmacéutico terminado incluyendo ensayoscuantitativos y pruebas límite.Categoría III . Métodos analíticos para la determinación de las características decomportamiento del producto o desempeño.Categoría IV: Métodos analíticos para la determinación de las características deidentificación.

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